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单克隆抗体的制备 单克隆抗体的制备 .txt 单身很痛苦,单身久了更痛苦,前几天我看见一头母猪,都觉得它眉 清目秀的什么叫残忍? 是男人,我就打断他三条腿;是公狗,我就打断它五条腿! 单克隆 抗体的制备 1975年 Kohler 和 Milstein 首先报道用细胞杂交技术使经绵羊红细胞(SRBC )免疫的小 鼠脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞融合, 建立起第一个B细胞杂交瘤细胞株, 并成功地制得抗 SRBC 的单克隆抗体(monoclonalantibody,McAb ) 。迄今全世界已研制成数以千的 McAb 。 单克隆抗体的理化性状高度均一, 生物活性单一, 与抗原结合的特异性强, 便于人为处理 和质量控制,并且来源容易,所以一问世便受到欢迎和重视。在医学领域中, McAb 在诊断疾 病、判断预后、防治疾病以及疾病机制研究等方面起着巨大的促进作用。为此,两位发明者 于 1984年获诺贝 ?? 窖 Ы薄 ? 第一节 杂交瘤技术的基本原理 杂交瘤抗体技术的基本原理是通过融合两种细胞而同时保持两者的主要特征。 这两种细胞 分别是经抗原免疫的小鼠脾细胞和小鼠骨髓瘤细胞。脾淋巴细胞的主要特征是它的抗体分泌 功能和能够在选择培养基中生长 (选择原理见后) , 小鼠骨髓瘤细胞则可在培养条件下无限分 裂、增殖,即 ?? 健坝郎 ? 毙浴T谘≡衽嘌 ?? 淖饔孟拢 ? 挥校孪赴 ? 牍撬枇鱿赴 ? 诤系脑咏幌赴 ? 啪哂谐中 ? 鲋车哪芰 Γ? 纬赏 ? 本弑缚固宸置诠 δ芎捅3窒赴 ? 郎 ? 粤街痔卣鞯南赴 ? 寺 F湓 ? 泶酉铝屑父鲋饕 ? 街璨 ? 鳌 ? (一)细胞的选择与融合 建立杂交瘤技术的目的是制备对抗原特异的单克隆抗体, 所以融合细胞一方必须选择经过 抗原免疫的B细胞,通常来源于免疫动物的脾细胞。脾是B细胞聚集的重要场所,无论以何 种免疫方式刺激,脾内皆会出现明显的抗体应答反应。融合细胞的另一方则是为了保持细胞 融合后细胞的不 ? 显鲋常 ? 挥兄琢鱿赴 ? 啪弑刚庵痔匦浴Q≡裢 ? 惶逑档南赴 ? 稍黾尤诤系某晒 β省6喾⑿怨撬枇鍪牵孪赴 ? 刀裥灾琢觯 ?? 允抢硐氲钠⑾赴 ? 诤习槁隆D壳俺S玫模孪赴 ? 鲋 暧 校 ?P3-X63-Ag8(Kohlerand Milstein,1975) ,P3-NSI/1-Ag4-1(Kohler and Milstein,1976) , X63-Ag8.653(Kearney et al,1979) , Sp2/0-Ag14(Schulman et al,1978) 等,这些细胞株皆为 HAT 敏感细胞株。 使用细胞融合剂造成细胞膜一定程度的损伤, 使细胞易于相互粘连而融合在一起。 最佳的 融合效果应是最低程度的细胞损伤而又产生最高频率的融合。聚乙二醇(PEG 1000~2000) 是目前最常用的细胞融合剂,一般应用浓度为 40%(W/V) 。 (二)选择培养基的应用 细胞融合是一个随机的物理过程。 在小鼠脾细胞和小鼠骨髓瘤细胞混合细胞悬液中, 经融 合后细胞将以多种形式出现,如融合的脾细胞和瘤细胞、融合的脾细胞和脾细胞、融合的瘤 细胞和瘤细胞、未融合的脾细胞、未融合的瘤细胞以及细胞的多聚体形式等。正常的脾细胞 在培养基中存活 ??5~7天,无需特别筛选 ,细胞的多聚体形式也容易死去。而未融合的瘤 细胞则需进行特别的筛选去除。 细胞的 DNA 合成一般有两条途径。主途径是由糖和氨基酸合成核苷酸,进而合成 DNA ,叶 酸作为重要的辅酶参与这一合成过程。另一辅助途径是在次黄嘌呤和胸腺嘧啶核苷存在的情 况下, 经次黄嘌呤磷酸核糖转化酶 (HGPRT ) 和胸腺嘧啶核苷激酶 (TK ) 的催化作用合成 DNA 。 细 胞 融 合 的 选 择 ? 嘌 ?? 杏 腥 ? 种 关 键 成 份 :次 黄 嘌 呤 (hypoxanthine,H ) 、 氨 甲 喋 呤 (aminopterin,A ) 和胸腺嘧啶核苷 (thymidine,T ) , 所以取三者的字头称为 HAT 培养基。 氨 甲喋呤是叶酸的拮抗剂,可阻断瘤细胞利用正常途径合成 DNA ,而融合所用的瘤细胞是经毒 性培养基选出的 HGPRT- 细胞株,所以不能在该培养基中生长。只有融合细胞具有亲代双方 的遗传性能,可在 HAT 培养基中长期存活与繁殖(图 11-1) 。 \par 图 11-1 细胞融合与 HAT 选择示意图 (三)有限稀释与抗原特异性选择 在动物免疫中, 应选用高纯度抗原。 一种抗原往往有多个决定簇, 一个动物体在受到抗原 刺激后产生的体液免疫应答,实质是众多B细胞群的抗体分泌。而针对目标抗原表位的B细 胞只占极少部分。由于细胞融合是一个随机的过程,在已经融合的细胞中,有相当比例的无 关细胞的融合体 ?? 杈 ?