1、6 二磷酸果糖对大鼠脑缺血再灌注损伤的保护作用.pdfVIP

1、6 二磷酸果糖对大鼠脑缺血再灌注损伤的保护作用 一、目的 探讨 1、6 二磷酸果糖（FDP）对大鼠脑缺血/再灌注（I/R）损伤的作用及其 机制。 二、方法 雄性 SD 大鼠 90 只，随机分为三组：假手术对照组（C 组）、脑缺血组（I 组）、果糖组（F 组），每组 30 只。I 组和 F 组大鼠在凝断双侧推动脉 24 小时后 夹闭双侧颈总动脉5分钟后重新开放，制作全脑缺血模型，C组只暴露不凝断锥 动脉和不夹闭颈总动脉，F组再灌注开始时静脉注射1、6-二磷酸果糖1.5ml/kg， I组及C组分别静脉注射生理盐水1.5ml/kg。各组在再灌注后2h、6h、12h、24h、 48h、72h 时取标本，测定血 SOD、MDA 含量，并制备脑组织病理切片，采用免疫 组织化学染色方法及TUNEL细胞原位凋亡检测法测定P38蛋白和Ref-1蛋白的表 达和凋亡细胞数目。 90只雄性SD大鼠，由西安交通大学医学院动物中心提供，体重275~325g， 随机分为3组：假手术组（C组）、缺血组（I组）、1、6-二磷酸果糖组（F组）， 每组30只，每组又分6个时点，每个时点随机取5只大鼠进行实验。 I组和F组大鼠凝断双侧椎动脉24h后，夹闭双侧颈总动脉5min后重新开放， [1] 用四血管法（4-VO） 制备全脑I/R损伤模型。C组只解剖暴露双侧椎动脉及颈总 动脉。大鼠腹腔注射2%戊巴比妥钠40mg/kg，再灌注开始F组经舌下静脉注射1、 6-二磷酸果糖 1.5mg/kg（浙江浙北药业有限公司），C、I组注射生 理盐水 1.5ml/kg。密切观察生命体征，观察瞳孔有无变化，呼吸有无增快及神 经功能有无异常。瞳孔无变化者予以剔除。 再灌注 2、6、12、24、48、72h，一部分取新鲜脑组织检测 SOD、MDA，一 部分以4%多聚甲醛200ml心脏灌注处死，取出完整大脑，固定于4%多聚甲醛中， 制备石蜡切片，用于HE染色、凋亡细胞检测和免疫组化染色。免疫组化采用SP 法，P38、Ref-1试剂盒均购于美国Santa Gruz公司，SP试剂盒购于福州迈新生 1 物工程公司，TUNEL凋亡试剂盒购于美国Oncogene公司。阳性细胞为棕黄色。 脑组织切片中显示细胞浆或细胞核有明显的黄色、棕褐色颗粒或斑片状为P38 和Ref-1 蛋白阳性。采用德国Leica-Q550E高清晰度彩色图文分析计算机系统对 阳性结果进行半定量测定其灰度值。 再灌注损伤后 1h、2h、6h、12h、24h、48h，用 4%多聚甲醛经心脏灌注固定， 断头取脑，制备石蜡切片，HE 染色观察细胞组织形态学变化。正常细胞结构清 晰可见，细胞核为兰色，核膜完整，核仁明显。 原位末端标记细胞凋亡试剂盒由美国 Oncogene 试剂公司提供。标本切片常 规脱蜡至水，DAB 显色、酒精脱水、二甲苯透明、中性树胶封片。显微镜下细胞 核中有棕黄色颗粒者为阳性细胞，即凋亡细胞。定量分析方法为：切片中免疫组 化显色阳性细胞定量采用显微镜计数法（10目镜×40物镜），每只动物随机两张 切片，每张切片随机观察5个视野。 计量资料以均数±标准差（ ±s）表示，采用SPSS11.0统计软件进行处理， 组间比较采用单因素方差分析，P0.05为差异有统计学意义。 三、结果 与 C 组的比较，I 组在再灌注后各时点 SOD 活性明显降低，MDA 含量明显升 高（P0.05），F组变化不明显，但较I组比较均有显著差异（P0.05）；与C 组 比较，I 组凋亡细胞显著增多（P0.05）；免疫组化染色显示：与 C 组比较，I 组在再灌注后各时点P38、Ref-1表达均显著增强（P0.05），F组较C组表达增 强但较I组表达显著减弱（P0.05）。 表 1 三组大鼠再灌注各时点脑组织 SOD 和 MDA 含量的比较