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PCR 微流控芯片 一． PCR 技术简介 聚合酶链反应(PCR polymerase chain reaction)技术是一种完美的体外无限扩 增核酸的技术。首先将 DNA 模板、引物(primer)、Taq 酶、缓冲液、dNTP(A、T、 C、G 四种碱基)等混合均匀，加热至一定温度（94℃)使模板失去活性，双链解 离，形成单链 DNA ，这个过程称之为DNA 的变性(melting or denaturation) ；然 后降温至一定温度(55℃) ，使引物和 DNA 模板复性，两者发生特异性结合，此 阶段称之为退火(annealing) ；最后再加热到一定的温度(72℃) ，使 Taq 酶活性达 到最大，在 Tap 多聚酶的作用下, 以dNTP 为原料, 以引物为复制的起点,合成新链， 此过程称之为延伸(extension) 。 这三个阶段可概括为：高温变性——低温退火——中温延伸。如此重复改变 反应温度,即高温变性、低温退火和中温延伸三个阶段为一个循环，每一次循环 使特异区段的基因拷贝数放大一倍，一般样品是经过 30 次循环，最终使基因放 大了数百万倍。将扩增产物进行电泳,经溴化乙锭染色,在紫外灯照射下肉眼能见 到扩增特异区段的DNA带。扩增产物量由公式Y=A(1+R)n 决定。其中A为模板拷 贝数,R为扩增效率,n为循环次数,一般循环次数为 20~45 次。 二． PCR 微流控芯片(PCR microfluidics) 第一代 PCR 是 PE-Cetus 公司的热循环仪。第二代是静态的微反应槽 PCR 芯片(micro chamber PCR chip) 。第三代PCR 技术是 PCR 微流控芯片。 下面我们从反应体积大小,循环时间的长短等几个方面对这三类 PCR 技术 做个比较。 通过表 1 的对比,我们可以看出 PCR 微流控芯片较前两种技术的优势是:在 保证一定扩增效率的前提下,反应体积可变,样品的输入和输出是连续的,反应从 静态变为动态;反应时间缩短。 PCR微流控装置主要可分为反应池内固定扩增式PCR(Chamber stationary PCR microfluidics),连续流动式PCR(Continuous-flow PCR microfluidics)和热对流 驱动PCR(Thermal convection-driven PCR microfluidics)三种形式。 1. 反应池内固定扩增式 PCR 是传统 PCR 扩增的微型化,其反应速度仍然受 PCR 反应体系的热容、反应池 衬底材料的热容、加热器以及传感器的热容等因素制约,因此需要对PCR 系统的 热容优化以便缩短反应时间和减少能量消耗。 一种反应池内固定扩增式 PCR 示意图 2. 连续流动式 PCR DNA 样品和反应试剂连续流动经过三个不同的恒温带,从而达到DNA 片段热 循环扩增的目的,该方法由于不需要反复地加热或冷却 PCR 装置,加热-冷却速度 一般不受 PCR 装置系统的热容所限制,反应速度较快。 一种连续流动式 PCR 示意图 3. 热对流驱动 PCR 热对流驱动 PCR 是基于 Rayleigh-Be´nard 对流原理。这种装置不需要借 助外力只需要浮力就能驱动 PCR 试剂流经不同的温度区，跟前两种相比，这种 芯片制造简单，价格低廉，而且具有更快的温度传导速度，更易于集成。 一种热对流驱动 PCR 示意图 三． 连续流 PCR 微流控芯片 连续流 PCR 微流控芯片有许多的设计形式： 振荡式(oscillatory devices)， 闭环式(closed-loop devices)和固定循环数式(fixed-loop devices) 。 1. 振荡式 PCR 试剂在微通道内不停的往复运动，穿梭于不同的温度加热区，所以循 环数是可以调节的。下图中，在注射泵的作用下，试剂先经过退火区和延伸区进 入变性区，完成 DNA 变性后穿过延伸区进入退火区完成引物退火。最后再进入 延伸区延伸，至此完成一个循环。在不同温度区的停留时间可以通过注射泵调节， 也可以通过微通道的结构进行设计。