放线菌新种分类鉴定讲解.pptxVIP

放线菌新种分离鉴定;1、实验目的;2、实验方法;2.1 分离方法;2011/12/28;A;A. 电镜;B. 培养特征;C. 生理生化实验;a. pH、盐浓度和温度耐受性;b. 明胶液化 ;c. 淀粉水解;d. 脲酶的产生 ;将待测菌种接在硝酸盐液体培养基中，置室温下培养，1、3、5d取样测定。每株菌作复本，另两管作对照。 培养液中加入格里氏试剂A、B液各一滴，如呈现粉红色、玫瑰红色，表明硝酸盐还原阳性，如无红色出现，则加1，2滴二苯胺试剂，如呈蓝色，表示培养液中仍有硝酸盐存在，硝酸盐还原属阴性，若不呈蓝色，表示硝酸盐和亚硝酸盐都已还原成其他物质，仍按阳性结果处理。;g. H2S的产生 某些细菌能分解含硫化合物如胱氨酸、甲硫氨酸而产生硫化氢气体，若于培养基中加入柠檬酸铁铵或醋酸铵，则与硫化氢作用生成硫化亚铁或硫化铅（黑色）沉淀。 h. 黑色素的产生 将供试菌株接种在酪氨酸培养基斜面管上，培养 7 d 和 14 d 观察结果，培养基被染成褐色或者黑色即说明该菌产生黑色素。 ;i. 碳源利用和氮源利用（本实验利用BIOLOG板）;A;A.细胞壁化学组分;胞壁类型;糖类型;全细胞TLC分析实验流程：;磷酸类脂位于放线菌细胞膜上，属于极性脂。不同属菌的磷酸类脂组份是不同的，它是鉴别属的重要特征之一，是化学分类项目中不可缺少的分类指征。磷酸类脂的种类繁多，但用于分类的指征并不多。 用于分类指征的磷酸类脂只有五种： 磷脂酰乙醇胺（phosphatidyl ethanolamine,PE） 磷脂酰甲基乙醇胺（phosphatidyl methyl ethanolamine,PME） 磷脂酰胆碱（phosphatidyl choline, PC） 磷脂酰甘油（phosphatidyl glycerol ,PG） 含葡萄糖胺的未知结构磷酸类脂（phospholipids of unknown structure containing glucosamine, GluNu） ;称取1g湿菌体于带螺口的40 ml离心管中。 加入15ml甲醇。 100℃水浴10 min，自然冷却。 加入10 ml氯仿和6 ml 0.5%NaCl。 用力摇匀10 min，静止可看到分层。 8000 rpm，离心10 min。 到入分液漏斗静止分层，取下层。 30-40℃旋转蒸干。 分两次各加入200μl氯仿/甲醇（2:1）冲洗器壁。 液体移入EP管（约100-200μl）,8000 rpm，离心10 min，去沉淀。 4℃保存备用。 ;实验流程：;C. 甲基萘醌测定;2011/12/28;菌体的收集制备 待测菌株用??体培养基培养，离心收集菌体，用蒸馏水洗涤两次，菌体于-80℃冷冻3d，冷冻干燥机抽干菌体，冻干菌体4℃干燥器保存备用。 醌的提取及纯化;D. 脂肪酸测定;2.2.3 基因型分类;A. G+C%含量分析;HPLC实验：;B. DNA-DNA分子杂交;2011/12/28;C. 16srRNA基因序列分析及进化树的构建