血清γ-球蛋白提纯.pptVIP

实验四　血清γ-球蛋白的提纯 【实验目的】 实 验 原 理 【实验原理】 【实验步骤】 【实验结果】 【注意事项】 * * 1.掌握盐析、凝胶层析、透析法分离纯化蛋白质的基本原理及操作； 2.掌握离心机的操作； 3.熟悉蛋白质定性检测的方法；　　 （一）盐 析 法 定义：加入大量中性盐以破坏蛋白质的稳定因素并 使从溶液中沉淀析出的现象。 原理: 破坏蛋白质两个稳定因素：水化膜和电荷层 中性盐：(NH4)2SO4、Na2SO4、NaCl等。 优点：蛋白质不变性，常用。 （二）透 析 法 定义：利用半透膜把大小分子分开的方法。 材料：特制的半透膜，截止分子量一般为一万。 临床应用：血液透析 （三）层析法 　　待分离物质随(流动相)经过一个固态物质(固定相)时，根据溶液中待分离物质颗粒大小、电荷多少及亲和力等，使待分离蛋白组分在两相中反复分配，并以不同流速流经固定相实现分离。 凝胶层析法 （四）离心技术 离心技术 是将含有微小颗粒的悬浮液置于离心转子中，利用转子绕轴旋转产生的离心力将微小颗粒按密度或质量的差异将其分离的方法。 沉降速度(v) 指在强大的离心力作用下，单位时间内物质颗粒沿半径方向运动的距离。 v=6.092×10-4×D2（ρ－ρm）n2r/ηm D — 颗粒直径 ρ — 颗粒的密度 ρm — 介质的密度 ηm— 介质粘度 r —旋转半径（物质质点所处位置与旋转中心的距离） N —转子转速  人血清中几种主要蛋白组分 占总蛋白的％ 分子量 等电点 血清蛋白质　　　　　　　　　　 12～20 156,000～950,000 6.85～7.3 γ－球蛋白　　 　　　 6.5～12 90,000～150,000　　 5.12 β－球蛋白　　　 　　　 4～9 300,000　 5.06 α2－球蛋白　　　　　　　　　 　　　 2～5 200,000 5.06　 α1－球蛋白　　 　　　 　　　　 57～72 69,000 4.64　 清蛋白　　　　 　　　　　　　　 【离心操作要领】 1、根据待离心的溶液性质及体积选择合适的离心管。装载液体时要按各种离心机操作说明进行。无盖离心管不能装的太满。密封的或有盖离心管常要求装满，以免离心管变形。 2、精确地平衡离心管及其内容物。 3、平衡后的离心管和内容物（包括套筒）应对称放置 4、启动离心时离心速度由慢到快，当到达离心时间时， 开启减速或速度调节旋钮减速。 （五）检测蛋白质、 NH4+的方法 ①检测蛋白质 双二缩脲试剂：溶液显紫红色 20％磺柳酸 ：有白色沉淀产生 ②检测NH4+ 纳氏试剂：黄色或棕色 1. 盐 析 透 析 脱 盐 4. 检 测 1.盐析 取离心管一支加入血清2ml 加入2ml PBS摇匀 逐滴加入pH7.2饱和(NH4)2SO4 2ml,摇匀 静止10分钟，再离心（2000转/分）10分钟 上清液（主要含清蛋白）倾入试管中 沉淀用1ml PBS搅拌溶解 逐滴加饱和(NH4)2SO4 0.5ml,摇匀 静止10分钟，再离心（2000转/分）10分钟 倾弃上清液（主要含α、β球蛋白） 沉淀即为初步纯化的γ－球蛋白 脱 盐 透析 2.透 析 清蛋白 换 水 ①透析袋未放入水中时,立即取水中液体检查有无NH4＋； ②放入水中后，每隔4分钟检查一次，共3次，比较NH4＋透出的情况。 ①约0.5小时，检查袋外液体的NH4＋； ②取袋外液2滴，置于小试管中，然后滴加20％磺柳酸1~2滴，观察有无沉淀产生。 3.脱盐 ②上样 γ－球蛋白，PBS 10滴溶解 ③加入洗脱剂 PBS 10~20ml ①装柱 葡聚糖凝胶G－25，柱 高1/2~2/3柱长，玻璃柱标识的200处。 流速：每分钟10滴左右 ④收集 20滴换一支试管 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 每组两块比色板,洗净备用。 一块在各孔滴加纳氏试剂（检测NH4+）,另一块滴加双二缩脲试剂（检测蛋白质）。若发现有显色反应此孔显色剂弃用。 不用滴管,避免污染,直接用试管倒… 用“-”表示无现象，用“+”, “++”, “+++”等表示颜色深浅 ⑥ 回收凝胶 ⑤.层析后洗脱液检测 表1. 层析后洗脱液的显色结果 表2. 透析后的袋外溶液显色结果 纳氏试剂检测后现象 缩二脲试剂检测后现象 10 9 8 7 6 5 4 3 2 1 试管编号 棕色（+） 现 象 20%磺柳酸 纳氏