EBVLMP2A和BZLF1融合基因重组腺病毒表达载体的构建　.docVIP

EBVLMP2A和BZLF1融合基因重组腺病毒表达载体的构建 】目的构建EB病毒(EBV)潜伏膜蛋白 2A (LMP2A)编码基因和即刻早期基因(BZLF1)融合基因的重 组腺病毒表达载体。方法逆转录？聚合酶链反应分别获得 LMP2A和BZLF1编码序列的cDNA，采用剪接式重叠延伸 (SOE)技术将两段基因通过多肽接头(Gly4Ser)3的DNA序 列进行连接，构建融合基因Z2A。将融合基因Z2A定向亚克 隆到p AdTrack?CM V质粒上，在原核细胞BJ 5183中完成穿 梭质粒与骨架质粒pA dEas y?l的同源重组，构建融合基因 Z 2A真核表达载体pA d?Z2Ao经抗生素培养板筛选重组体 然后转染293细胞，获得复制缺陷型重组腺病毒vAd?Z2Ao 结果重组腺病毒载体经限制性核酸内切酶酶切，电泳后可 观察到长31kb和k b两条DNA条带，测序鉴定结果表明序 列正确；从感染重组腺病毒vAd ?Z2A的293细胞中检测到 融合基因Z2A的表达。结论本研究成功地构建了 EBVLMP2A 和BZLF1融合基因Z 2A重组腺病毒表达载体，为进一步研 究Z2A的功能提供了实验基础。 关键词】疱疹病毒4型人潜伏膜蛋白2A基因BZLF1 基因融合表达载体 [ABSTRA CT] Objectiv eT oconstruc t Z2Arecombi nantadenovi rusvectoran dstudythee f fectofZ2A ex pression onE BV?asso ciat edtumo r. Met hodsB othLMP 2Aan dBZLFlc DNA wereclon ed fromB95?8 c elllinebyR T?PCR, andth efusiongene (LMP2A?lin k er?BZLFl) wa sconstru cte dbyusin gapo lypept ideli nker (Gly4Se r)3. Z2Avect orp Ad?Z2Awa sc onstructe d byingtheZ2 Afusiongene intopAd?eas yleukaryot i cexpressi ng plasmid, 293 cellswe retr ansfec tedwi thpAd ?Z2A.R esul tsTheel ect rophores is ofEcoRVan d Bgl II digest edproductss howedtwoDNA fragmentsw h ichwere31 kb andkb,re spe ctively .The result ofDNA seque ncingd emon strated tha tZ2Aha.de di ntheexpec t edsiteandt heionsequen cewasexactl ycorrect. T h eresultss ho wedthatZ 2Ap ositive reco mbinan taden oviru scould expr essZ2A. Con clusionZ 2A recombina n tadenoviru svectorhasb eenconstruc tedandcanb e usedforfu rt herresea rch . [KE YWORD S] her pesvir us4, human:L MP2 A;gene, B ZL FI; genefu s ion; expres sionvector EB病毒（EBV）是具有B淋巴细胞嗜性的疱疹病毒，为 重要的DNA致瘤病毒，与多种人类恶性肿瘤，如B urkit t淋 巴瘤、鼻咽癌（NP C）、何杰金病、免疫缺陷病人的B淋巴 细胞瘤、胃癌及肝癌等的发生有关。EBV对宿主细胞的感染 有潜伏感染和裂解期感染两种类型。研究表明，EBV阳性癌 组织中主要以潜伏感染的形式存在，EBV基因组存在于几乎 所有的癌细胞，因此可以EBV基因组或编码产物为靶点对E BV相关肿瘤进行特异性治疗［1?3 ］。本研宄拟将EBV潜伏 膜蛋白2A(LMP2 A )编码基因和即刻早期基因(BZLF1)进行融 合，进而构建融合基因的重组腺病毒表达载体，为进一步 探讨融合基因表达对EBV阳性肿瘤细胞增殖的影响提供实 验基础。现将结果报告如下。 1材料和方法 主要试剂、质粒和细胞株 本文 T4DNA 连接酶、X DNA /HindUL DL20 OOMarker、 限制性内切酶EcoRV、B gill均购自宝生物工程(大连) 有限公司；DN A转染试剂盒lipof ectam ine2⑻0购自I nvitrog en公司；质粒提