《华东理工生物化学chap》课件.pptVIP

返回 用两种限制酶处理载体也可防止环化 钝性末端连接法 用前述的化学合成法、逆转录法获得的DNA或cDNA片断，以及某些限制酶切生成的DNA片断，均为钝性末端，可用T4DNA连接酶连接，也可将其改造成粘性末端再行连接： 1、加接头：这种人工接头含某种限制酶的单切点，用限制酶消化该接头可产生粘性末端。 2、加尾巴：应用末端转移酶在载体与外源DNA分子上加上互补的同聚核苷酸，经过退火可使两者形成重组体 返回 钝性末端连接法 返回 末端转移酶处理 退火 二、重组DNA引入宿主细胞和筛选鉴定 重组DNA引入宿主细胞 1、转染：将噬菌体DNA引入宿主细胞的过程 2、转化：将质粒或染色体DNA引入宿主细胞的过程 重组体克隆的筛选与鉴定 1、插入灭活法 2、噬菌斑形成筛选法 3、核酸杂交法 返回 插入灭活法 目前使用的质粒载体都有抗药标记。被转化的细菌在含有这种（些）抗生素的培养基中能够生长，而未被转化的细菌则不能生长或被杀死。然而，当限制酶作用于载体DNA的某一抗药基因上并在此插入外源DNA时，载体上原有的抗药基因即被破坏。由此重组体转化的宿主细胞，则对这个抗生素敏感，这样便可筛选出转化菌株。 返回 返回 插入灭活法 限制酶切 转化 含四环素 T A＋T 三、克隆基因的表达 外源基因在大肠杆菌体系中的表达 外源基因在真核细胞体系中的表达 返回 四、基因工程的成就与展望 在农业上的成就与意义 在工业方面的成就与意义 在制药工业中的成就与意义 癌症的研究与治疗 遗传病的预防与治疗 插入灭活法 目前使用的质粒载体都有抗药标记。被转化的细菌在含有这种（些）抗生素的培养基中能够生长，而未被转化的细菌则不能生长或被杀死。然而，当限制酶作用于载体DNA的某一抗药基因上并在此插入外源DNA时，载体上原有的抗药基因即被破坏。由此重组体转化的宿主细胞，则对这个抗生素敏感，这样便可筛选出转化菌株。 返回 谢谢！ 生物化学 第十五章 基因工程基本原理 华东理工大学生物化学精品课程组 华东理工大学 精品课程系列 第十五章 基因工程基本原理 一、基因工程的定义及主要内容 二、重组DNA分子引入宿主细胞和筛选鉴定 三、克隆基因的表达 四、基因工程的成就和展望 一、基因工程定义及主要内容 基因工程也称基因重组技术、基因克隆或分子克隆 是指利用DNA重组技术生产或改造生物产品、创建或改良动植物品种以及开发特殊用途的微生物等 是生物工程的重要内容之一 返回 主要步骤： 1、构建DNA重组分子 2、重组DNA分子引入宿主细胞和筛选鉴定 3、基因的表达 一、基因工程定义及主要内容 返回 返回 基因工程基本程序 真核染色体DNA 克隆载体 （质粒） 限制酶切割 限制酶切割并 分离所需片断 重组载体 细菌宿主细胞的转化 细胞分离 培养增值 构建DNA重组分子 工具酶 目的基因的制备 克隆载体 DNA分子的体外重组 返回 工具酶 限制性内切酶是基因工程中最主要的工具酶 DNA连接酶（DNA ligase）、DNA聚合酶Ⅰ（DNA polymeraseⅠ）、末端转移酶（terminal transferase）、逆转录酶（reverse transcriptase）、核酸酶S1（nuclease S1）和核酸外切酶Ⅶ（exonucleaseⅦ） 返回 限制性核酸内切酶 能识别DNA特定核苷酸序列的核酸内切酶 分布：主要在微生物中。 特点：特异性，即识别特定核苷酸序列， 切割特定切点。 结果：产生黏性未端（碱基互补配对）。 举例：大肠杆菌的一种限制酶能识别GAATTC序列，并在G和A之间切开。 限制性核酸内切酶 由Smith在1970年从流感噬血菌中发现 细菌体内有特异的限制修饰系统，这种修饰系统是通过特殊的修饰酶在细菌本身DNA的特异识别序列处进行甲基化修饰，从而与外源DNA相区别。这样，限制性核酸内切酶就能去切割破坏外源DNA，而对本身无影响。 目前已从原核生物中分离出400～500多种限制性核酸内切酶 限制性核酸内切酶 限制性内切酶可识别4或6个特异核苷酸序列 粘性末端：指限制性内切酶的切割部位不在识别序列的中心轴，在断段产生一个短的单股突伸出来的不齐末端。 钝性末端：指限制性内切酶的切割部位在识别序列的中心轴处，即产生平齐末端。 返回 几种限制性内切酶的作用位点 返回 几种限制性内切酶的作用位点 返回 目的基因的制备 目的基因就是所需要克隆的外源基因 制备方法： 1、人工合成法 2、逆转录法 3、用限制性内切酶直接从染色体DNA中分离 4、用PCR法扩增目的基因片段 返回 目的基因的制备：人工合成法 较小分子基因可用人工化学合成的方法获得 DNA化学人工合成的方法已经自动化 人工合成目的基因的先决条件是基因的核苷酸序列是已知的 缺点是：1、不能合成