武陵山羊肚菌液培养条件优化研究.docVIP

武陵山羊肚菌液体培养条件优化研究-农学论文 武陵山羊肚菌液体培养条件优化研究 刘达玉１，王慧超２，郑林用３，戴 玄２，李宗堂４，陈今朝２ （１．成都大学生物产业学院，成都 ６１０１０６；２．长江师范学院生命科学与技术学院，重庆 ４０８１００；３．四川省农业科学院，成都 ６１００６６；４．成都榕珍菌业有限公司，成都 ６１１７３３） 摘要：对武陵山羊肚菌（Ｍｏｒｃｈｅｌｌａ ｅｓｃｕｌｅｎｔａ）的液体培养条件、培养基进行了优化。结果表明，最适液体培养条件为ｐＨ ６．０、培养液装量１００ ｍＬ／２５０ ｍＬ、接种量８％、温度２５ ℃、摇床转速１８０ ｒ／ｍｉｎ、培养时间６ ｄ；最适发酵培养基为４．０％蔗糖、０．７０％酵母粉、０．１５％ Ｋ２ＨＰＯ４和０．１０％ ＭｇＳＯ４·７Ｈ２Ｏ。在此条件下，菌丝体干重为６．８８０ ｇ／Ｌ，胞外多糖产量为０．８６１ ｇ／Ｌ。 关键词 ：武陵山羊肚菌（Ｍｏｒｃｈｅｌｌａ ｅｓｃｕｌｅｎｔａ）；液体培养；菌丝体；胞外多糖 中图分类号：Ｑ９４９．３２ 文献标识码：Ａ 文章编号：０４３９－８１１４（２０１５）０２－０４０５－０４ ＤＯＩ：１０．１４０８８／ｊ．ｃｎｋｉ．ｉｓｓｎ０４３９－８１１４．２０１５．０２．０３７ 羊肚菌（Ｍｏｒｃｈｅｌｌａ ｅｓｃｕｌｅｎｔａ）是一种营养丰富、美味可口的珍贵食药用菌，其性平、味甘，益肠胃、化痰理气，补肾、壮阳，补脑、提神，具有增强肌体免疫力、抗疲劳、抗衰老、降血脂、抗病毒和抑制肿瘤等功能［１，２］。虽然国内外已有一些羊肚菌人工栽培的报道，但由于其对气候、土壤等环境条件要求苛刻，至今仍未实现规模化栽培［３－６］。自然资源很少，远不能满足市场需求。为此，笔者分离重庆武陵山羊肚菌，并对其液体培养条件进行了优化，拟为其人工栽培、食品和药品开发提供依据。 １ 材料与方法 １．１ 材料 菌种：武陵山羊肚菌，长江师范学院生物技术实验室分离保存。 母种ＰＤＡ培养基：２０％马铃薯（去皮）煮汁，２．０％葡萄糖，０．３０％蛋白胨，１．８％琼脂，０．１０％ Ｋ２ＨＰＯ４，０．０５％ＭｇＳＯ４·７Ｈ２Ｏ，ｐＨ自然［７］。 液体种子培养基：１０％马铃薯煮汁，２．０％葡萄糖，０．５０％蛋白胨，０．１０％Ｋ２ＨＰＯ４，０．０５％ＭｇＳＯ４，ｐＨ ６．０［８］。 发酵培养基：４．０％葡萄糖，０．５０％蛋白胨，０．１０％Ｋ２ＨＰＯ４，０．０５％ＭｇＳＯ４·７Ｈ２Ｏ，ｐＨ ６．０。 １．２ 方法 １．２．１ 菌种活化 把保藏的羊肚菌母种转接到无菌ＰＤＡ培养基平皿上，２５ ℃培养７ ｄ，备用。 １．２．２ 液体培养方法 将种子培养液装入２５０ ｍＬ锥形瓶中，每瓶１００ ｍＬ，０．１０ ＭＰａ、１２１．３ ℃灭菌２０ ｍｉｎ，冷却，接羊肚菌母种于锥形瓶中，１６０ ｒ／ｍｉｎ、２５ ℃培养３ ｄ备用［９］。发酵培养液装量同种子培养液，培养条件相同，培养时间６ ｄ。 １．２．３ 发酵培养基选择 选取蔗糖、酵母粉、Ｋ２ＨＰＯ４、ＭｇＳＯ４·７Ｈ２Ｏ ４个因素，设计Ｌ９（３４）正交试验，因素与水平见表１。通过试验，筛选最佳培养基配方。 １．２．４ 菌丝体干重测定 取发酵液３０ ｍＬ，在４ ０００ ｒ/ｍｉｎ离心１０ ｍｉｎ，沉淀菌丝体用去离子水洗涤３次，于７０ ℃下烘干至恒重，称重，每个处理重复３次。 １．２．５ 羊肚菌胞外多糖测定 参照武秋立等［１０］的方法，取出菌丝体羊肚菌发酵液加入３倍乙醇于０ ℃下沉淀１２ ｈ，于４ ０００ ｒ／ｍｉｎ离心１０ ｍｉｎ；弃上清液，沉淀加少量乙醇再离心，重复两次后，将沉淀用去离子水溶解定容，用硫酸－蒽酮法于６２０ ｎｍ处测吸光度，根据硫酸－蒽酮葡萄糖标准曲线计算胞外多糖产量。 １．２．６ 数据处理 试验数据用ＤＰＳ ７．０５版软件处理，用ＬＳＤ法比较菌丝体干重和多糖的差异显著性。 ２ 结果与分析 ２．１ 液体培养条件选择 ２．１．１ ｐＨ对菌丝体干重和多糖产量的影响 用２．０ ｍｏｌ/Ｌ HCl或氢氧化钠溶液调节培养液ｐＨ分别为４．０、５．０、６．０、７．０、８．０，接种培养（表２）。当ｐＨ ６．０时，菌丝体生长最快，其干重和胞外多糖产量均最高； ｐＨ ６．０与ｐＨ ７．０菌丝体干重之间差异不显著，而ｐＨ ６．０与ｐＨ ５．０胞外多糖产量之间差异极显著；当ｐＨ ４．０时，菌丝体干重及多糖产量均最低。可见，菌丝体生长、多糖形成的最适ｐＨ为６．０。 ２．１．２ 培养液装量对菌丝体干重和多糖产量的影响 250 mL三角瓶分别装６０、８０、１００、１２０、１４０ ｍＬ培养液（表３）。当培养液装