《寡聚半乳糖醛酸对云南》-课件.pptVIP

寡聚半乳糖醛酸对云南红豆杉细胞悬浮培养中紫杉醇及10-去乙酰基巴卡亭Ⅲ生物合成的影响 院 系：药学院 专 业：生物制药 作 者：许栋华 指导老师：王剑文 副研究员 背景简介 紫杉醇(taxol) 作为一种作用机制独特的植源性抗癌新药。但由于紫杉醇天然含量很低，加上资源本身亦非常贫乏，因此限制了紫杉醇的进一步开发和应用。为了解决其药源问题，科学家在寻找及扩大紫杉醇药源途径上（如筛选高产量红豆杉栽培品种、化学合成、生物技术及微生物中生产等）进行了艰苦的研究工作。近年来，细胞培养技术已成为对红豆杉属植物研究的重要手段。 10-去乙酰基巴卡亭 Ⅲ （10-deacetyl baccatin Ⅲ，10-DAB Ⅲ） 是紫杉醇生物合成的重要前体物质，本身亦有抗癌活性。法国研究小组发现10-DAB Ⅲ可从欧洲红豆杉的针叶中提取，其产率可达0.1%，10-DAB Ⅲ的发现为通过连接紫杉醇侧链半合成紫杉醇提供了较佳方法。迄今已在数种红豆杉属植物中分离到该成分。它不仅来源广泛，而且提取的效率也较高，是一种较易检测及广阔开发前景的紫杉烷类物质。 寡聚半乳糖醛酸（OGA）为果胶的不完全酶解产物，其单体半乳糖醛酸是组成植物细胞壁中果胶质的主要成分，参与细胞壁复杂网架的形成。以OGA为诱导物，可诱导多种植物（如拟南芥、番茄、胡萝卜、马铃薯等）产生抗性反应，促进人参细胞中有效次生代谢产物人参皂苷的合成，本实验测定结果可见，OGA可显著提高云南红豆杉细胞中10-DAB Ⅲ及紫杉醇的含量。 第一部分 云南红豆杉悬浮培养细胞生长周期内紫杉醇及10-去乙酰基巴卡亭Ⅲ含量的变化 第二部分 寡聚半乳糖醛酸诱导云南红豆杉悬浮培养细胞最佳浓度的筛选 第三部分 寡聚半乳糖醛酸诱导云南红豆杉悬浮培养细胞最佳收获时间的筛选 第一部分 云南红豆杉悬浮培养细胞生长周期内Taxol及10-DAB Ⅲ含量的变化 1 材料与方法 1). 云南红豆杉细胞的培养 研究用的细胞系是经多次继代培养的云南红豆杉（T. yunnanensis）细胞株。在改良的MS固体培养基上继代培养。将生长良好的细胞3 g 转入含30 mL MS液体培养基的150 mL三角瓶中，25℃，110 r/min黑暗振荡培养。 2). 红豆杉细胞的处理 本实验将云南红豆杉细胞悬浮培养，分别于接种后第0、1、4、7、10、13、16、19、22 d 收获细胞，提取紫杉醇及10-DAB Ⅲ，HPLC法检测其含量，每种处理3个重复，共8组。 3). 紫杉醇及10-DAB Ⅲ的含量分析 色谱条件：10-DAB Ⅲ含量测定：色谱柱（Restek C18柱：150 mm×2.1 mm，5 μm），流动相为甲醇-乙腈-水（2：3：8），检测波长为232 nm，流速为0.2 mL/min，柱温为35℃，进样量为10 μL。 Taxol含量测定：色谱柱（Restek C18柱：150 mm×2.1 mm，5 μm），流动相为甲醇-乙腈-水（25：35：45），检测波长为227 nm，流速为0.2 mL/min，柱温为35℃，进样量为10 ml。 第二部分 寡聚半乳糖醛酸（OGA）诱导云南红豆杉悬浮培养细胞浓度的筛选 1 材料与方法 1)． 红豆杉细胞的培养 （见第一部分1.1.1） 2 )．OGA诱导子的制备 　　多聚半乳糖醛酸经果胶酶室温下裂解20min，过滤，浓缩后冻干成粗OGA粉末。将OGA粉末配成1 g/L溶液，经Sephdex G-10 柱处理滤除MW700的寡聚物，所得溶液浓缩后用0.45 μm微孔滤膜过滤除菌，作为OGA诱导子备用。 3 )．红豆杉细胞的诱导处理 　本实验将培养的云南红豆杉细胞分成对照组及处理组，处理组设4种不同诱导子浓度，分别为20、40、60、80 μg/mL，对照组加入同量双蒸水。每种处理4瓶，共4个重复。细胞培养至第17天加入OGA，继续培养至第24天收获。 4 )．10-DABⅢ及紫杉醇的含量分析 （见第一部分1.1.3） 第三部分 寡聚半乳糖醛酸（OGA）诱导云南红豆杉悬浮培养细胞最佳收获时间的筛选 1 材料与方法 1). 红豆杉细胞的培养 （见第一部分1.1.1） 2 ). OGA诱导子的制备 （见第二部分1.1.2） 3 ). 红豆杉细胞的处理 本实验将云南红豆杉细胞悬浮培养至第13 d加入诱导子OGA（40 mg/mL）