近来对MDA方法的改进.ppt

使用多重置换扩增（MDA）技术对单细胞基因组进行测序 摘要 目前单细胞微生物可以通过对多重置换扩增反应（ MDA）得到的扩增DNA进行测序。在细菌中几个飞克 (10-15g)的DNA能扩增得到微克(10-6g)的高分子量DNA，扩增得到的DNA 适合DNA文库的构建和Sanger测序。MDA生成的DNA也可直接作为模板供焦磷酸测序。单个细胞间基因序列的联系也是一个功能强大的工具，它可用于对从环境DNA的提取物（宏基因组序列）得到的多重有机体通过鸟枪法测序来指导构建基因芯片。 背景知识 MDA是最近几年发展起来的一种全基因组扩增技术,它采用具有高度延伸活性的DNA聚合酶和耐核酸外切酶的随机引物在等温条件下对基因组进行扩增的方法,这种方法是以链置换为基础,最初被用于扩增巨大的环状DNA如质粒和噬菌体DNA,现在也被用于线型DNA的扩增,它能对全基因组进行高保真的均匀扩增, 扩增出10～100 kb大小的片段,能提供大量均一完整的全基因组序列。 MDA反应示意图 　　最近的工作表明了单细胞测序能有利的揭示环境和生理研究甚至从局部草案基因组中预测基因的存在。基因组数据还可以在这个过程中协助作用，最终发展为新的培养方法，这仍然是一个需要充分认识生物有机体的极为重要的目标。代谢途径的鉴定可以预测培养基和培养条件的设计。基于MDA的单细胞基因组学的另一个好处是它很容易自动化，并可以与高通量细胞筛选大量的微生物相结合。MDA的反应物经PCR筛选信号序列，如16 S rRNA和recA基因，可以用来确定目的基因，用于其它的分析。 应用： 通过MDA进行单细胞的DNA扩增和基因组测序 微生物的发现 单细胞测序和宏基因组学方法的综合 近来对MDA方法的改进 MDA反应利用随机引物和独特的Phi 29 DNA 聚合酶(该酶对于模板有很强的模板结合能力，能连续扩增100kb的DNA模板而不从模板上解离。同时这种酶具有3’—5’外切酶活性，可以保证扩增的高保真性) 反应扩增DNA。一个链置换反应使从每个模板得到的多个副本作为聚合酶合成新链 ，同时取代先前延长的链。与MDA相比，老的基于随机或简并引物PCR来进行全基因组扩增的方法，MDA创造了更大的扩增偏好性。它们还可以产生很短的扩增产物。MDA扩增平均12 kb的长度和范围大于100 kb的序列，使它们更适合用于克隆和DNA测序。 来自相同细胞株的几个不同的细胞的MDA产物也可以被用来完成基因组测序。扩增的偏好性在一次MDA反应到下面的反应中相当随机的发生在不同的序列。同样，一次MDA反应中序列的缺失也会发生在其它的细胞中。为确认MDAs的选择能从相同细胞株真实获得，PCR筛选和循环测序可以对MDA反应产物的16S rRNA基因和其他标记基因进行。从同样的细胞类型产生的单细胞MDA产物的所产生的汇集物可以提供较全面的甚至代表所有的序列，也是达到基因文库完整覆盖的一种很有前途的策略。 另外，如果在MDA反应前可以对细胞汇集，基因组的覆盖范围能够得以改善。在细胞分选技术中通过荧光原位杂交（ FISH ）探针或独特的自体荧光，通过在显微操作中的形态特征观察，如果一个单一的细胞株因为局部富集生长或一些微环境作用（例如感染细菌或作为宿主的共生）占主导地位，这使得对相同细胞株的细胞进行识别成为可能。 FISH技术是一种重要的非放射性原位杂交技术。它的基本原理是:如果被检测的染色体或DNA纤维切片上的靶DNA与所用的核酸探针是同源互补的，二者经变性-退火-复性，即可形成靶DNA与核酸探针的杂交体。将核酸探针的某一种核苷酸标记上报告分子如生物素、地高辛，可利用该报告分子与荧光素标记的特异亲和素之间的免疫化学反应，经荧光检测体系在镜下对待测DNA进行定性、定量或相对定位分析。 　　从单一的未培养细胞测序首先是通过对用显微操作分离的取自环境的土壤细菌进行了分析。显微操作高度确保了只有一个细胞被选择，也提供了在分离过程中观察和拍照的形态学信息。使用单细胞MDAs产物作为模板，对16S rRNA基因进行PCR得到测序的基因文库。 以往的获得的最初一些基因组序列，是通过使用FISH的特异探针来选取单个细胞。 目前，一个混合的策略可以通过16S rRNA基因的PCR提取环境总DNA，基于观测种群的16S rRNA FISH 探针来分离细胞，通过单细胞测序并结合宏基因组的鸟枪测序来合并基因组。 FISH探针被用来通过细胞流式细胞仪分离候选细胞。 细胞通过微流控芯片分离，并在1个60 nl的体系内进行MDA。此方法使用微流控渠道以达到细胞分选，以及MDA的小体积反应能达到单拷贝DNA模板的更好目标。 　即使单一细胞的部分序列也可以大大的推动生物学研究： 一个单细胞测序的序列草图估计可以覆盖Beggiatoa sp