用Trizo-法提取RNA.docxVIP

用Trizol 法提取RNA 什么是Trizol？Trizol 是一种总RNA抽提试剂，内含异硫氰酸胍等物质，能迅速破碎细胞，抑制细胞释放出核酸酶。 由于RNA酶无处不在和其难以灭活的顽固本性，RNA的抽提环境应严格控制，所用试剂耗材均应是RNase-free或经过DEPC处理过的，具体的注意事项可参见上一篇文章《分子狗，你还在谈qRT-PCR色变吗？》。 接下来我们着重从实验步骤的各个阶段进行剖析： 一，样品准备 ①从组织中提取总RNA 液氮研磨，将组织块放入研钵中，加入少量液氮，迅速使用研杵研磨，期间不断加入液氮，直到组织研磨成粉末状。每50-100 mg组织加入?1 ml?Trizol，转入1.5 ml EP管中进行后续操作。 匀浆，组织体积不要超过Trizol体积的10%，用匀浆器充分匀浆，直到无明显颗粒，转入1.5 ml EP管中进行后续操作。 ②从细胞中提取总RNA 贴壁细胞，去除培养基，用适量无菌PBS清洗细胞表面，加入1 ml Trizol，用带滤芯的RNase-free枪头反复吹打细胞，将收集的样品置于RNase-free的离心管中，冻存在-80℃冰箱备用。 悬浮细胞，收集细胞悬液，1000×g离心5 min，弃培养基；用适量无菌PBS清洗细胞，1000×g离心5 min弃上清，沉淀加入1 ml Trizol，用带滤芯的RNase-free枪头反复吹打细胞，将收集的样品置于RNase-free的离心管中，冻存在-80℃冰箱备用。 ③从细菌中提取总RNA ? 对于细菌或蛋白质、脂肪、多糖或细胞外基质含量高的样品，需要额外的分离步骤。加入Trizol吹打混匀后，4℃，12000×g，离心10 min。将上清转移至新的RNase-free的离心管中，存在-80℃冰箱备用。 二，RNA提取 ①将冻存的RNA样本从-80℃冰箱取出置于冰上解冻。 ②?于每管样本中加入200 μl?RNA专用的三氯甲烷(每毫升Trizol加200 μl)，置于振荡器震荡1 min，冰上静置5 min。 ③4℃，12000×g，离心10 min。 ④?此时液体分三层，将上层的水相转移到另一个RNase-free的离心管中。 ⑤加入等体积的-20℃预冷的RNA专用的异丙醇，上下颠倒混匀，于-20℃静置15 min以上。 注：增加-20℃的静置时间会增加RNA尤其是miRNA的得率。 ⑥4℃，12000×g，离心15 min，小心弃上清。 ⑦加入1 ml预冷的75%的乙醇（25% DEPC无菌水，75% RNA专用无水乙醇）涡旋混匀。 ⑧4℃，7500×g，离心10 min，尽量去除离心管中的残液，然后在无菌操作台中风干约10 min（注意不要过度干燥，否则难以溶解）。 ⑨每个离心管中加入适量的RNase-free的ddH2O溶解沉淀，用枪头吸打混匀，至完全溶解。离心几秒，让离心管中的液体全部在管底，然后置于冰上。 ⑩去除杂质DNA： ?a在RNase-free的离心管中配制以下去除RNA中DNA的体系反应液： Reagent Volume Total RNA 10 μg 10×DNaseI buffer(Mg2+) 5 μl DNaseI (1U/μl) 10 μl RNase Inhibitor（40U/μl） 0.5 μl DEPC-treated water up to 50 μl b???加入25 μl 50 μM的EDTA，65℃反应10 min。 c ??用RNase-free的ddH2O定容到100 μl。 d???加入10 μl 3M NaAc和250 μl冷乙醇，混匀后-80℃放置30 min以上。 e???4℃，12000 rpm离心10 min，弃上清。 f???加入75%的冷乙醇，4℃ 12000 rpm离心10 min，尽量弃上清。 g???打开EP管盖子，在操作台中风干约10 min。 h 用适量的RNase-free的ddH2O溶解后，使用Nanodrop-2000测RNA的浓度。 琼脂糖电泳检测RNA的完整性：建议使用DEPC处理的ddH2O配置1.2%琼脂糖凝胶，DEPC处理的ddH2O稀释TAE缓冲液。 *完整的RNA经凝胶电泳后会明显地观察到28S和18S两条带，并且28S的条带亮度约是18S的两倍。若两条条带不明显，则提示RNA可能部分降解。 *提取的RNA可用于后续操作，如需用qRT-PCR检测基因表达，为避免RNA降解，建议提完RNA后立即将RNA逆转录成cDNA进行保存，cDNA可在-20℃长期保存。 常见问题及解决办法