基因工程《生物技术与生活》《生物技术概论》教学课件—视图选择纯黑白即可使用.ppt

质粒的一般生物学特性 质粒DNA不仅能在细菌中 复制，并且在添加真核复 制信号和启动子后，可以 构建出能在原核和真核细 胞中均可复制的穿梭质 粒，并在真核细胞中表 达，因此这类载体在基因 工程中应用广泛。 质粒的拷贝数与不亲和性 质粒的拷贝数 指某种质粒在一个细菌细胞内的数 目。根据每个寄主细胞中质粒拷贝数的多少，把质 粒分为严紧型复制质粒（拷贝数少，为1?5个）与 松弛型复制质粒（拷贝数多，可达10?200份拷 贝）。因此，作为载体的质粒应该是松弛型的。 质粒的不亲和性（不相容性） 指在没有选择压力 的情况下，两种亲缘关系密切的不同质粒，不能在 同一个寄主细胞系中稳定地共存的现象。在细胞的 增殖过程中，其中必然有一种会被逐渐地排斥（稀 释）掉。 Amp 基因工程 大肠杆菌质粒载体 是应用最广泛的克隆载体，含有大肠杆菌源质粒 Col E1复制起始位点（Col-ori），能够在转化的大 肠杆菌中按质粒复制的形式进行复制。pBR322是一 种常用的典型的质粒载体。 HindIII BamHI PstI SalI ScaI r pBR322 (4.36 kb) ori Amp 1.分子量较小（4363bp） 而拷贝数较大，每个 细胞中可累积1000? 3000个拷贝。 2.具有两种抗菌素抗性 基因：apr（氨苄西林 抗性基因）、tcr（四 环素抗性基因），可 作为筛选转化子的选 择标记基因。 BamHI SalI HindIII PstI ScaI r ori pBR322 (4.36 kb) pBR322质粒载体 ?特点 pUC18和pUC19质粒载体 EcoRI SacI KpnI SmaI BamHI XbaI SalI PstI SphI HindIII HindIII SphI PstI pUC18 SalI XbaI BamHI SmaI KpnI SacI EcoRI Ori LacZ (2.68kb) Apr pUC19 MCS 为便于外源DNA 片段的克隆，在载 体合适的位置上组 装一个多克隆位点 （MCS）连杆，如 质粒载体 pUC18、 pUC19。二者的差 别在于MCS上各种 克隆位点的走向相 反，便于用两种内 切酶酶切产生的一 个DNA片段以正反 两个方向组入载体。 基因工程 蓝藻穿梭质粒载体 某些蓝藻含有内源质粒，但不能直接作 为载体用于转化蓝藻，必须构建成穿梭载 体，即除大肠杆菌质粒载体必备元件外，还 必须含有蓝藻质粒的复制起始位点，如p33图 2-10。 ORI 基因工程 农杆菌Ti质粒载体 Ti质粒（tumor inducing plasmid）：诱癌质 粒。致癌农杆菌含有一种内源质粒，可引起许多双 子叶植物的根癌。 Ti质粒是一种双链环状DNA分子，长200kb， 是一个大型质粒。当前，Ti质粒已成为植物遗传工 程研究中的重要载体。一些具有重要性状的外源 基因可借DNA重组技术设法插入到Ti质粒中，并 进一步使之整合到植物染色体上，以改变该植物 的遗传性，达到培育植物优良品种的目的。 Ti质粒 基因工程 酵母2μm质粒载体 酵母是一种最简单的单细胞真核生物，几乎所 有的酿酒酵母中都存在一种质粒，即2μm质粒。 一般将酵母2μm质粒构建成穿梭质粒载体，含 有2μm质粒的复制起始位点和大肠杆菌源质粒 的复制起始位点。 基因工程 T-克隆和U-克隆载体 用于T-A克隆的载体称为T-克隆载体。5’端带有一 个不配对的碱基T,可将PCR产物以TA配对连接的 方式直接克隆。 用于U-T克隆的载体称为U-克隆载体。5’端带有一 个不配对碱基U的线性质粒，可将PCR产物以UT 配对连接的方式直接克隆。 ? T-克隆载体两条链的5’端含有一个游离的T ? PCR过程中，普通的Taq酶可在产物的3’端多 加一个A T-A克隆 基因工程 DNA 2.病毒（噬菌体）克隆载体 把感染细菌的病毒称为噬菌体，由此构件的载体 称为噬菌体载体。 噬 菌 体 蛋白质 头部 尾部 尾丝 噬菌体感染细菌示意图 λ噬菌体克隆载体 λ噬菌体优点 ① 其分子遗传学背景十分清楚； ② 载体容量较大，一般质粒载体只能容纳10kb，而 λ噬菌体载体却能容纳大约23kb的外源DNA片段； ③ 具有较高的感染效率，其感染宿主细胞的效率几 乎可达100%，而质粒DNA的转化率却只有0.1%。 ?