牛内标准基因地基因组筛选及其在标准制定和肉制品鉴定中地应用.pdf

华中农业大学2013届硕士研究生学位(毕业)论文 2．2．5基因组E}N～总RNA提取…………………………………………………．．18 2．2．6 eDNA第一链的合成…………………………………………………………．20 2．2．7 TNFRSFl0A基因序列的克隆测序……………………………………………20 2．2．8内标准基因拷贝数的qPCR验证……………………………………………21 2．2．9 PCR反应体系优化……………………………………………………………22 2．2．10扩增片段的电泳检测，回收及测序………………………………………．23 3结果………………………………………………………………………………………………………………～24 3．1BLAST筛选结果及分析…………………………………………………………．．24 3．1．1 BLASTp结果及分析…………………………………………………………．24 3．1．2 3．1-3基于外显子的候选牛内标准基因筛选………………………………………26 3．2牛内标准基因TNFRSFl0．4序列克隆……………………………………………28 3．4牛TNFRSFl0．4内标准基因表达谱半定量………………………………………30 3．5．1引物设计和优化………………………………………………………………30 1 3．5．2引物浓度优化…………………………………………………………………3 3．5．3退火温度及模版浓度优化……………………………………………………32 3．6种问特异性检测…………………………………………………………………．．33 3．7种内保守性检测…………………………………………………………………．．34 3．8灵敏度测试………………………………………………………………………一35 3．9检测限………………………………………………………………………………35 3．10检测限重现性平行实验…………………………………………………………35 3．11国家标准文本起草与专家意见征求……………………………………………36 3．12复核验证…………………………………………………………………………．36 4讨论………………………………………………………………………………………………………………．．38 4．1BLAST配置及筛选策略…………………………………………………………38 4。2PCR检测体系优化………………………………………………………………．．39 4．3内标准基因的筛选策略…………………………………………………………．．39 4．4动物源性产品检测和内标准基因………………………………………………一40 4．5特异基因的针对性研究…………………………………………………………～40 4．5．1蛋白特异核酸非特异基因—；，FJ……………………………………………40 Ⅱ 牛内标准基因的基凼组筛选及其在标准制定和肉制品鉴定中的应用 4．5．2 TNFRSFl0．4基因物种间比较…………………………………………………41 4．6关于本研究的思路………………………………………………………………．．43 5／J、结………………………………………………………………………………………………………………．44 5．1本研究的主要成果与结论………………………………………………………．．44 5．2本研究的创新点和特色…………………………………………………………．44 5．3本研究的不足与进一步研究的建议……………………………………………．45 6攻读硕士期间完成的其他工作一巾外猪种CNV分析与验证……………………．46 6．1研究背景…………………………………………………………………………．46 6．1．1 CNV、CNVR的概念……………………………………………………………．46 6．1．2猪CNV研究进展……………………………………………………………46 6．1．3 CNV的检测及验证