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四色FACS应用原理及实用操作  生物治疗研究中心   周春保 张晖  流式细胞术 流式细胞术（Flow Cytometry, FCM）是一种可以快速、 准确、客观，同时检测单个微粒（通常是细胞）的多项特性，并加以定量的技术，同时可以对特定群体加以分选 研究对象为生物颗粒，如各种细胞、微生物及人工合成微球等 研究的微粒特性包括多种物理及生物学特征，并加以定量 了解 了解 常 用 荧 光 素的应用 细胞收获--电压 细胞收获—电压和补长 样品处理--常见影响因素 细胞洗涤缓冲液 红细胞裂解液 细胞膜渗透液 细胞固定液 荧光抗体量 流式细胞仪不同显示图的比较 荧光单抗 IMK试剂合 CD3 FITC/PerCP；CD4 FITC/PE/PE-Cy5/APC；CD8 FITC/PE CD25 APC/PE；CD45RO APC/PE；CD56 FITC/PE Lin1 FITC,HLA-DR PerCP／PE，CD123 PE,CD11C PE CD45RA FITC；CD16 PE ,CD161 APC ,CD24 PE,CD19 PE,CD86PE CD80 FITC CD40 FITCCDPE,CD1a FITC GRANZYME A FITC,GRANZYME B FITC, Perforin FITC,foxp3 FITC/PE CD209 FITC (DCsign), CD3 PerCP-Cy7/CD4 FITC/CD8 PE(三色) CD3PerCP-Cy7/CD4 FITC /CD25 PE(三色) IgG1 PE/FITC/APC,IgG 2a FITC/PE, IgG2b-k FITC CellQuest分析软件应用 CellQuest简介 CellQuest是从流式细胞仪上进行获取和分析数据的通用软件 CellQuest可从流式细胞仪上获取3色或4色样品进行分析 CellQuset 是所有自动软件的基础SimulSET,MultiSET----- 工具板 1 关键词 实用操作 数据的分析-可信区间的设定--门 数据的分析-可信区间的设定-形态和活性 数据的分析-可信区间的设定-同型 数据的分析-可信区间的设定-目的细胞 数据的分析-可信区间的设定-表 * * 液流系统 光学系统 电子系统 分选系统 流式细胞仪的检测原理 FACSCalibur特点/优势 世界上分析速度超快的台式机（104细胞/秒） 独特的分送和浓缩系统，大大提高细胞应用率 双激光：488nm/635nm 四色荧光＋2散射光=6参数 FACSCalibur 了解 常见的荧光素荧光强度 APC＞PE＞PE-Cy5＞FITC＞ＰerCP 了解 应用 应用 Componsation 点图 3维图 直方图FSC 直方图SSC 密度图 等高图 单抗（我室）： 关键词 File Edit Plots Gates CellQuest的主介面 2 3 4 5 6 7 8 9 10 14 13 11 12 １、等高图/轮廓图 ２、３维图 ３、密度图 5、点图/散点图 工具板 ６、直方图marker 4、直方图 ７、缩小 １２、放大 8、矩形 　9、直方图 10、箭头 　11、象限的marker １３、多边形１４、椭圆形 关键词 New Document Size Save Print Quit 关键词 Copy Undo Select All Paste cut overlay Histogram Plot Dot Plot 关键词 Region List Gate List 关键词 关键词 Gate Stats Quadrant Stats Analysis Select File Gate Option Show Title Single Apple键+F键可弹出Dot Plot参数对话框 圈门 参数设置 Ｘ-Ｐarameter Y-Ｐarameter 实用操作 Gate 荧光组合 实 用 操 作 以 Treg 为 例 Gate List设置 实 用 操 作 实用操作 Stats Gate Stats Quadrant Stats 参数设置 重要的实用操作方法 Apple键＋Ｆ键可弹出Dot Plot参数对话框 Apple键＋D键可以打开单个CellQuest文件 Apple键＋ 椭圆 用鼠标进行360度旋转 Apple键＋Ｃ键复制图 Apple键＋Ｖ键粘贴图 Apple键＋Ａ键全选图