蛋白酶活性的测定方法与原理.pptxVIP

蛋白酶活性的测定方法及原理 罗老师 组员 宁舒婷 陈丽君 陈海梅 王熙栋 各种测定方法及原理 考马斯亮蓝法 甲醛滴定法 DHT-酪蛋白法 DNA-溴乙锭荧光分析法 X-光胶片法 福林酚法 甲醛滴定法 3 考马斯亮蓝染料与蛋白质在酸性条件下结合，主要是染料与蛋白质中的碱性氨基酸（特别是精氨酸）和芳香族氨基酸残基相结合，使染料的最大吸收峰的位置由465nm变为595nm，溶液的颜色也由棕黑色变为兰色，在595nm下测定的吸光度值A595，与蛋白质浓度成正比。 考马斯亮蓝法 4 蛋白酶催化蛋白质水解成氨基酸，再用甲醛固定氨基酸的氨基，用0.1mol/LNaOH溶液滴定生成的氨基酸，从而测定其酶活。 考马斯亮蓝法 甲醛滴定法 5 用5-氨基四唑重氮盐将氨基酸中部分组氨酸和酪氨酸重氮化，得到黄色的重氮5-氨基四唑酪蛋白（DHT-酪蛋白）。以DHT-酪蛋白为底物，在蛋白酶作用下，水解生成DHT-肽，二价离子可与DHT-蛋白与DHT-肽形成稳定的可溶性红色螯合物，而锌离子可迅速沉淀DHT-酪蛋白，但不沉淀DHT-肽。选用合适浓度的锌离子和镍离子作为沉淀剂和显色剂，利用比色法可测定蛋白酶酶活。 考马斯亮蓝法 DHT-酪蛋白法 6 溴乙锭插入双链DNA的碱基对之间时，可使DNA的荧光增加25倍。接近饱和的溴乙锭(0.5µg/mL) 与DNA 混合时，其荧光增加量与DNA的浓度呈正比。在DNA-组蛋白