IFA和IPMA方法测定猪瘟兔化弱毒病毒含量.DOC

IFA和IPMA方法测定猪瘟兔化弱毒病毒含量 李晶梅，朱薇，秦红刚，靖志强，廖园园，于义娟，肖敏，袁刚，谢红玲作者简介：李晶梅，硕士，从事兽用疫苗方面的研究。? 作者简介：李晶梅，硕士，从事兽用疫苗方面的研究。 ? 通讯作者：谢红玲。E-mail@163.com （武汉中博生物股份有限公司，武汉 430070） 摘要：本研究使用间接免疫荧光方法（IFA）和过氧化物酶单层试验（IPMA）测定猪瘟兔化弱毒的病毒含量（TCID50）。优化了两种方法的一抗使用浓度，都使用以韩国JBT公司猪瘟单抗作为为例，一抗，此单抗的稀释倍数最高为300倍。筛选出IPMA方法中敏感、易辨识的酶作用底物Trueblue，Trueblue过氧化物酶底物显色的、感染猪瘟兔化弱毒的阳性细胞呈现蓝色易于辨识，所以确定Trueblue为IPMA方法中的酶作用底物。建立的优化后的IFA和IPMA方法与兔体反应热法进行了比较，证明两者存在一定平行关系，但IFA和IPMA比兔体反应热法检测结果的数值低1个数量级左右。基于以上结果，TCID50方法可作为猪瘟疫苗效力检验的候选方法。 关键词：猪瘟兔化弱毒；TCID50；IPMA；IFA IFA and IPMA for HCLV titer detection LI Jing-mei, ZHU Wei, QIN Hong-gang, JING Zhi-qiang, LIAO Yuanyuan , YU Yi-juan, XIAO Min, YUAN Gang , XIE Hong-ling , QI Shi-hua, WEN Wen-sheng (Wuhan Chopper Biology Co. Ltd, Wuhan 430070, China) Abstract: ：Indirect immunofluorescent assay (IFA)and Immunoperoxidase monolayer assay(IPMA) were used to titrate the Tissue Culture Infectious Dose 50（TCID50） of Hog cholera lapinized virus (HCLV) vaccine. Optimized antibody dilution and Peroxidase Substrate. JBT corporation’s CSFV mAbs used was no more than 300 times dilution. Positive cells incubated with TrueBlue Peroxidase?Substrate showed blue, and easy to distinguish. IFA and IPMA can titer TCID50 of finished and semi-finished products of HCLV vaccine. There are some parallel relationship between RID and TCID50. RID is about one order of magnitude than TCID50. Based on the research, TCID50 will be used as candidate efficacy method . Key words: hog cholera lapinized virus ; TCID50；IPMA；IFA 猪瘟病毒（CSFV）C株，又名猪瘟兔化弱毒株（HCLV），由其制备的猪瘟兔化弱毒活疫苗是广泛使用的主流猪瘟疫苗。兔体感染量（RID）和猪体半数保护量（PD50）是评价疫苗效力的指标。动物的饲养状况、健康状况等个体差异也会对检验结果产生影响。荧光定量PCR定量CSFV是新近发展的一种定量方法，但无法区分病毒的死活，在活疫苗效力检验方面没有应用意义。TCID50是病毒含量的测定方法之一，病毒在细胞内繁殖引起细胞病变（CPE），通过CPE的判定，计算病毒含量。CSFV不引起CPE，所以CSFV 病毒含量测定要结合免疫荧光方法（FA）、间接免疫荧光方法（IFA）或过氧化物酶单层试验（IPMA）等免疫学方法进行判定。 结合IFA和IPMA的CSFV TCID50的效价测定方法见于很多报道[1-3]。不同机构使用不同种类的细胞、猪瘟抗体、二抗、显色底物，各试剂的加入量和作用时间也不尽相同。材料和方法的多样性方便其他机构根据自身条件建立各自的CSFV测定方法。由于各文献并未对方法中的操作进行标准化，所以在实际应用中各反应条件均需逐一优化。本研究参考前人方法、结合自身经