Hi-TOM使用说明.PDFVIP

Hi-TOM 使用说明 工作原理：利用两次普通 PCR 完成高通量测序文库的快速构建，并用Hi-TOM 在线网站自动解析出多样品多位点的详细变异信息，可灵敏检测包括基因编辑突 变在内的任何DNA 变异和详细基因型信息。 1、Hi-TOM 流程图 2 、Hi-TOM 试剂盒样品排布图 1 操作步骤 Step1: PCR 引物设计 根据常规PCR 引物设计原则进行引物设计；靶点需在离左引物或者右引物的10-100 bp 范围内。正向引物5’端加正向搭桥序列5’-ggagtgagtacggtgtgc-3’；反向引物5’端加反向搭 桥序列5’-gagttggatgctggatgg-3’。 例： 正向引物 F: 5’-ggagtgagtacggtgtgcgtgaacgatgcgggtggcgcgctg-3’ 反向引物 R: 5’-gagttggatgctggatggacacacttacccatcctctcctct-3’ 注：黄色表示待检测的靶点序列，紫色为PCR 特异引物序列。 Step2: 第一轮PCR 扩增目的片段 利用引物进行常规PCR 扩增目的条带（不能有染料）。PCR 结束后取3-5µL 产物进行电 泳检测，确保扩出目标条带。 Step3: 用Hi-TOM 试剂盒进行第二轮PCR，完成文库构建 （排枪加样，省力且防止混样） 每孔PCR 反应体系： Hi-TOM Mix （每孔对应） 10 µl ddH2O 9 µl 第一轮PCR 产物 1 µl 总体积 20 µl PCR 程序： 94℃，2 min ； 94 ℃，30 sec； 57℃，30 sec； 33 cycles 72℃，1 kb/min； 72℃，5 min PCR 结束后取3-5µL 产物进行电泳检测。第二轮PCR 产物比第一轮产物长100 bp左右。 将第二轮PCR 产物混合 （可以用排枪把不同行的样品先混在第一行，再将这几个孔里 的样品混合，节省工作量），取混合后的PCR 产物200 µL，进行琼脂糖凝胶电泳，切胶回收 2 纯化。送公司进行高通量测序，送样文库浓度需大于0.8 ng ／µL，总量大于30 ng 且送样体 积不得小于 10ul （参照诺禾致源公司的高通量测序标准）。不同靶位点样品可以混在一起送 样。普通变异检测，960 个PCR 反应，只需1 G 的测序数据就可获得可靠结果。 Step4: 测序结果在线分析 直接将测序压缩数据上传到以下网址 （/hi-tom/ ）。 Job title 必须输 入一个任务名称，只能输入字母和数字，不能有空格，最后会作为输出结果的前缀；reference sequence 输入参考基因组序列，参考网站示例存为FAST 格式的txt 文档，可输入多条靶序 列，建议输入PCR 扩增序列或靶位点左右各500bp。选择过滤的百分比阈值，默认过滤5% 以下的突变；输入用于接收分析结果的邮箱输入后，点击Submit 按钮，开始上传数据并自 动分析，1 G 数据大约需要8 分钟上传时间，分析结果大约在 10 分钟内自动发送至邮箱。 每组靶位点会生成2 个Excel 文件：一个为所有样品的详细变异信息列表，另一个为对应的 基因型信息列表。 3 输出结果示例 表1.各样品的详细突变信息列表 （包括reads 数、突变频率和序列信息等） 表2.各样品的基因型信息列表 4 备 注 1. 参考序列TXT 文档制作 以FAST 格式做输入序列格式，以便区分多靶点中不同靶位点序列，不熟悉FAST 格式， 建议从网站下载参考序列模板