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Sanger法测序-2013年培训.pdf
Sanger法测序
单基因疾病产品开发
楚玉星
chuyuxing@genomics.cn
Outline
DNA测序概述
Sanger法测序原理
Sanger法自动化-ABI3730XL
Sanger法应用举例
DNA测序概述
定义:
*基因是遗传信息的物理和功能单位,含有产生
一条多肽链或功能RNA所必需的全部核苷酸序列,即
一段DNA序列
*基因的不同,是其碱基组成和排列顺序的不同
*用一定的方法测定并分析靶基因的碱基组成和排
列顺序(即DNA的一级结构)即为DNA测序
DNA测序概述
DNA测序的意义:
该技术是现代分子生物学中的一项重要技术
测序是进一步研究基因的功能、基因结构与功能关
系的基础
在临床,可为疾病的分子诊断提供最精确的判定依
据
(可以提供序列资料的分子诊断是分子诊断的黄金
标准)
DNA测序概述
测序技术发展
Outline
DNA测序概述
Sanger法测序原理
Sanger法自动化-ABI3730XL
Sanger法应用举例
5´端
C
双脱氧链末端终止法 (sanger法)
【1977;Fred Sanger 】
测序原理:
(1)DNA合成 A
在DNA聚合酶催化
下,前一个核苷酸的
3’-OH与再接上来的一
个核苷酸的5’-P之间
形成3 , 5 -磷酸二 G
酯键,从而连接形成多
核苷酸链 3 ´端
Sanger法测序原理
(2)链合成的人为终止
链终止剂--双脱氧核苷三磷酸(ddNTP)
什么是ddNTP? 终止合成的原理?
(3)试想,如在DNA合成体系中,加入少量ddNTP,会
出现什么结果?
加入的ddNTP会与其相应的dNTP之间展开竞争,竞争着被参
入正在延伸的DNA链中;结果,两者随机参入链中相应位置
当dNTP参入, 则链继续延伸
当ddNTP参入,则链延伸终止
形成一系列长短不一的多核苷酸链,特点:
**起点相同--引物
**尾—不同,是特异的相应的碱基
**长度各一:长度由待测序列的碱基顺序决定
(4)测序时,每个反应体系的组成
DNA聚合酶
单链DNA模板(待测片段)
带有3-OH末端的单链寡核苷酸引物
Mg2+
原料-dNTPs(dATP,dGTP,dCTP和dTTP)
终止剂-ddNTPs(ddATP,ddGTP,ddCTP和ddTTP)
反应分为四个独立的反应体系,每个反应体系加入四种
dNTP和其中一种ddNTP
(5)在四组独立的DNA合成体系中,分别产生四组
以各自特异的ddNTP为末端、长短不一的多核苷酸
链
(6)通过高分辨率的变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分
离:其可区分长度差一个核苷酸的单链DNA
(7)放射自显影检测后,从凝胶底部到顶部按
5′→3′方向读出新合成链序列,由此推知待测模
板链的序列
Sanger
双脱氧
测
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