半乳糖凝集素3在人孕早期绒毛和蜕膜中的表达及对胚胎发育的影响妇产科学专业.docVIP

PBS缓冲液（0. 01M PH7. 2-7. 4） 上海立瑶生物科技有限公司 THzol （总RNA提取试剂）（R0016） 碧云天生物科技有限公司高效率逆转录试剂 盒（Fsk-100 ） 东洋紡（上海）生物科技有限公司引物合成 上海生工生物工程技术服务有限公司SYBR Green Realtime PCR Master Mix-Plus （QPK-212）东洋纺（上海）生物科技宥限公司 1.2.2主要仪器 免疫组化防脱玻片 上海仪涛生物仪器有限公司石蜡切片机（AS325） 英国 SHANDON 漂烘片机（YABO）常州市博雅电子设备有限公司65°C电热恒温鼓风干燥箱（DIIG- 9140A型）上海一恒科学仪器有限公司美的自动电饭煲（MB-YH16 ） 广东美的电饭煲制造有限公司 封片机 德国Leica ZEZSS光学显微镜 蔡司光学仪器（上海）国际贸易有限公司台式离心机（X-22R） 美国Beckman Coulter公司隔水式恒温培养箱（GHP-90801） 上海 一恒科学技术仪器有限公司 PCR仪 （ep gradien ） 德国Eppendorf公司 实时炭光定量PCR仪（eprcalpcx4） 德国Eppendorf公司 1.3实验方法 1.3.1标本米集 收集手术流产组、药物流产组、稽留流产组，新鲜的绒毛及蜕膜组织，PBS洗净 血液，将每例标木分成两份，一份即刻于液氮中浸泡后，快速冻存于_80°C冰箱内， 待用以提取RNA;另一份组织于福尔马林液中固定，行石蜡包埋，待行免疫组织化学 检测。 1.3.2免疫组织化学法 石蜡块连续切片，厚度为3um。应用免疫组织化学两步法检测绒毛和蜕膜中的半 乳糖凝集素-3。 石蜡切片常规脱蜡水化。 将切片浸于0.01M拧檬酸缓冲液（PH=6）中，电饭煲加热修复，煮沸lOmin, 保温10min,自然冷却30min。 PBS洗涤3次,各5min。 滴加T抗（半乳糖凝集素-3工作浓度1:500）约50-lOOul,切片置于湿盒内 4C过夜。 PBS洗涤3次，各5min。 滴加 II 抗（SupcrPic Ture） 50~100ul,室温静置 15min。 PBS 洗涤 3 次，各 5min。。 DAB显色5分钟，放入自来水中终止显色。 苏木素复染2分钟，盐酸酒精分化。 自来水冲洗。 脱水、封片、镜检。以磷酸盐缓冲液（PBS）代替一抗作阴性 对照。 1.3.3实时荧光相对定量PCR法（Real-time RT-PCR ） 1提取细胞总RNA分别取黄豆粒人小的绒毛及蜕膜组织于液氮中研磨成粉末 ?待液氮蒸发后，取2 小勺粉末加入Trizol 1ml-*用力摇晃15下左右并打匀一室温下放罝10分钟-＞加入 三氯甲烷（按800Trizol:200三氯甲烷）一混匀，待静置不分层一分两个离心管（12000 转速，4°C）离心15分钟一取上层透明液体加入无水酒精及异丙醇混合液（己放罝 于-20°C下10分钟）达试管平面一离心20分钟（12000转速，4°C）,可见白色沉淀 —加入无水酒精及DEPC混合液（7:3） 700ul冲洗白色沉淀一离心1分钟（12000转 速，4°C）—吸净酒精一离心半分钟（12000转速，4°C）―吸净酒精，黑色记号笔在 白色沉淀处标记一打开试管盖子，置于37°C孵化箱10分钟一可见白色沉淀基木透明, 加入20ulDEPC水一常温下放置5min。 3.2 RT-PCR （20ul 体系） TOC \o 1-5 \h \z 5 X Buffer 4ul 10mm dNTP 2ul （olg） dT20 lul Relor Trace-u lul RNace Inhititor lul RNA 7ul Depc~H20 4ul 3. 3荧光定量PCR （20ul体系） 蒸馏水 3.6ul SYBR Green Realtime PCR Master Mix- lOul Plus solution 2ul 正向引物（lOum） 1.2ul 反向引物（lOum） 1. 2ul 模板 2ul 按文献［18］合成Galectin-3引物序列，上游引物序列为：5’-CTT CCA CTT TAA CCC ACG CTT CAA-3’，下游引物序列为:5’-TGT CTT TCT TCC CTT CCC CAG TTA TT-3’， 扩增片段长度为93bp。以18s核糖体为内参照，其上游引物序列为：5’-CAGCCA CCC GAG ATT GAG CA-3’，下游引物序列为:5, -TAG TAG CGA CGG GCG GTG TG-3’， 扩增 片段长度为252bp。荧光定量PCR仪为:Eppendorf real pi ex4 ,反应条件为:95 °C 预变性2min, 95°C