实验三 兰氏染色.pptVIP

* * 微生物学实验 生命科学实验教学中心510室 实验三 革兰氏染色 实验目的 2. 掌握细菌涂片和革兰氏染色基本程序。 1. 理解革兰氏染色的原理。 革兰氏细菌的细胞壁结构 实验原理 ?革兰氏阳性细菌的细胞壁主要是由肽聚糖形成的网状结构组成的。 ?在染色过程中，当用乙醇处理时，肽聚糖脱水而孔障缩小，通 透性降低，使结晶紫-碘复合物被保留在细胞内而不易脱色， 因此，呈现蓝紫色，用G+表示。 实验原理 ?革兰氏阴性细菌的细胞壁中肽聚糖含量低，而易被乙醇溶 解的类脂质含量高。 ?当用乙醇处理时，类脂质溶解，细胞壁的通透性增加，使 结晶紫-碘复合物易被乙醇抽出而脱色，然后又被染上了复 　染液的颜色，因此呈现红色，用G-表示。 实验器材 （一）金黄色葡萄球菌,大肠杆菌,土壤分离细菌。 （二）革兰氏染色液：（结晶紫染液；Lugol碘液；95%乙 醇；稀释石炭酸复红染液），载玻片，酒精灯，接 种环，吸水纸，香柏油，擦镜纸等。 （三）光学显微镜。 实验步骤 一、细菌涂片的制作 取干净载玻片一块，在载玻片的左、右各加一滴单蒸水， 　按无菌操作法取菌涂片，做成浓菌液。 2. 再取干净载玻片一块将刚制成的浓菌液挑2-3环涂在玻片 两边制成薄的涂面，注意取菌不要太多。 3. 将玻片反复在酒精灯上方通过几次（用手指触摸涂片反　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　面，以不烫手为宜），对标本进行干燥、固定（也可自然干燥）。 ?待涂片冷却后，再加染色液。 涂片制作 1. 初染：在涂片上加结晶紫（以盖满细菌涂面为宜），染色 约1分钟后水洗。 2. 媒染：滴加Lugol碘液染色1分钟，水洗。 3. 脱色：把玻片上的水吸净，用95%酒精滴洗玻片，直到滴出 的酒精刚好不出现紫色，大约20秒钟，立即用水洗。 4.复染：滴加稀释石炭酸复红染液染色1-2分钟，水洗后涂片用吸水纸吸干或者放空气中晾干。 二、革兰氏染色 革兰氏染色流程图 (1)先用低倍镜观察，再用高倍镜观察，找出适当的视野。 (2)将高倍镜转出，然后在涂片上加香柏油一滴。 (3)将油镜头浸入油滴中仔细调焦观察细菌的颜色和形态。 三、涂片观察 油镜工作原理 金黄色葡萄球菌(10×40) 大肠杆菌(10×40) 四 实验完毕后的处理： 1.将浸过油的镜头按照下述方法擦拭干净： a.先用擦镜纸将油镜头上的油擦去。 b.用擦镜纸沾少许二甲苯（?）将镜头擦2-3次。 c.再用干净的擦镜纸将镜头擦2-3次。` ?注意擦镜头时向一个方向擦拭。 2.镜检后的染色玻片用纸将香柏油擦干净。 1.涂片后要注意固定、干燥，以免标本被冲洗掉。 注意事项 2.革兰氏染色成败的关键是酒精脱色。 ?如果脱色过度，革兰氏阳性菌也可被脱色而染成阴性菌。 ?如果脱色时间过短，革兰氏阴性菌也会被染成革兰氏阳性菌。 ?脱色时间的长短受涂片厚薄及乙醇用量多少等因素的影响， 难以严格界定。 4. 选用幼龄的细菌。选用培养16h-24h菌龄的细菌为宜。若菌龄 太老，由于菌体死亡或自溶常使革兰氏阳性菌转呈阴性反应。 3. 染色过程中勿使染色液干涸。用水冲洗后，应吸去玻片上的 残水，以免染色液被稀释而影响染色效果。