工程大肠杆菌制备甲羟戊酸的研究-生物化工专业论文.docx

万方数据 万方数据 论文题目：工程大肠杆菌制备甲羟戊酸的研究 专 业：生物化工 硕 士 生：谢 萌 （签名） 指导教师：贺诗华 （签名） 摘 要 甲羟戊酸（MVA）是异戊烯焦磷酸（IPP）合成的关键性前体物质，而萜类化合物 又由 IPP 经催化合成，所以 MVA 可以通过 MVA 途径间接合成各种类异戊二烯化合物， 并广泛应用于食品，医药和化工行业，且市场需求旺盛。由于传统方法原料难得，能耗 高，对环境污染大，且不能合成天然型的甲羟戊酸内酯（MVAL），并不适合大规模工 业生产。生物法合成 MVA 可利用生物质降解得到的葡萄糖及工业废水中的乙酸等为原 料，具有资源可持续及绿色环保的优势，成为目前的研究热点。本研究选择工业微生物 常用菌株 Escherichia coli 作为生物催化剂，建立了以葡萄糖、乙酸等为底物，生物合成 MVA 的合成体系。 本研究首先以重组大肠杆菌 YJM16 为供试菌株，进行 5 L 发酵罐匀速补料的高密 度发酵实验，最终细胞产量达到 54.48 g·L-1，MVA 产量达到 40.43 g·L-1，产率为 20.2 %。 然后根据 Logistic 方程、Luedeking-Piret 方程和类似 Luedeking-Piret 方程，拟合出重组 大肠杆菌高密度发酵过程中菌体生长、MVA 合成、基质消耗的动力学模型及模型参数。 结果表明，MVA 的合成与重组大肠杆菌的生长速率及菌体积累量均有关。菌体生长模 型、底物消耗模型和产物生成模型拟合度 R2 分别达到了 0.9319、0.9578 和 0.9751，可 用于描述利用重组大肠杆菌高密度发酵生产 MVA 的过程。 过量表达 acs，maeB，sfcA，yfcC，pckA 和 ppsA 六种基因及共表达 acs 和 maeB， sfcA，yfcC，pckA 及 ppsA 五种基因，构建出利用乙酸为碳源的重组菌株，进行摇瓶筛 选，选出最优菌株；经摇瓶筛选发现，过量表达乙酰辅酶 A 合成酶 ACS 利于乙酸的分 解利用，过量表达苹果酸酶 SFCA 和 MAEB 提供还原力，过量表达利用乙酸的糖异生 关键酶 PCKA 和 PPSA 及局部调控因子 YFCC，对乙酸利用及产物合成均没有明显作用， 说明胞内还原力及糖异生途径并不是影响产物合成的关键因素。利用乙酸的最优菌株为 表达 acs 的菌株 FHR-2：产量和产率分别为 368 mg·L-1 和 6.9 %，较原始菌株分别提高 了 31.4 %和 1.47 %。 最后放大到 5 L 发酵罐水平进行验证，首次利用乙酸为碳源，获得 MVA，并对初 碳源的种类及溶氧条件进行优化，得出最优发酵条件：碳源为 20 g·L-1 葡萄糖，溶氧控 制在 20 %，通过自动流加氨水，硫酸将 pH 控制在 7.0。培养温度 37 oC 至葡萄糖耗尽， OD600nm 约为 19，诱导前调整为 32 oC，添加 IPTG（终浓度为 0.5 mM），诱导基因表达， 持续发酵 60 h，补料为乙酸铵以 4 g·L-1·h-1 的速率进行流加。实验结果：发酵结束时， OD600 为 20，MVA 产量为 8.63 g·L-1，补加乙酸铵后的产率为 29.5 %（理论产率为 81.67%）。 关键词：甲羟戊酸；工程大肠杆菌；动力学；高密度发酵；乙酸 研究类型：应用基础研究 Subject : Study of Synthesis Mevalonic Acid for Escherichia coli of Engineering Specialty : Biochemical Engineering Name : Xie Meng （Signature） Instructor : He Shihua （Signature） ABSTRACT Mevalonic acid (MVA) as a key precursors of isopentenylpyrophosphate (IPP) synthesized, which can indirectly synthesis various isoprenoid compounds by MVA pathway, and widely use in food, medicine and chemical industry. Otherwise, it has an increasing market demand. However, the productions are subject to various problems by traditional methods, such as scarcity of raw materials, hi