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专业技术参考资料
急 性 毒 性 试 验 方 法
――改良寇氏法
K?rber法由K?rber于1931提出,后经Finney改进,顾汉颐作过改进,1963年孙瑞元教授对该法进一步改进,改进后的计算方法称为点斜法或孙氏法,增加了不含0%和100%死亡率的校正式,所得LD50及全部有关参数与正规概率单位法相近。
改良寇氏法(K?ber)试验设计的原则是:各组剂量按等比级数;各组动物数相等:大致有一半组数的动物死亡率在10%~50%之间,另一半在50%~100%之间,最好出现0 %和100 %的剂量组。
一、剂量选择及分组
1、剂量选择
剂量设计是否合理是急性毒性试验能否成功的关键。
探求外源化学物的急性毒性,测定其LD50或LC50时,应首先广泛查阅文献资料,了解该化学物的化学结构和理化性质,如结构式、分子量、溶解度、挥发度、纯度及杂质含量等,其次确定测定LD50的计算方法,然后设计剂量。
2、预试验:
总的原则是先用少量动物,以较大的剂量间距染毒,求出粗略的致死剂量范围,即确定受试动物全部致死的最小剂量(b)和全部不致死的最大剂量(a),即求出待测化学物0 %~100 %的大致致死剂量范围,然后在这个剂量范围内按几何级数的间距设计5~7个剂量组,组间剂量呈等比级数(r),其比值为1.2~1.5。进行正式实验。
用于急性毒性试验时,动物的体重为:大鼠180~200g,小鼠18~22g,豚鼠200~250g,家兔2~2.5kg,犬10~12 kg。用于实验的同一批动物体重变异范围不得超过所用动物平均体重的20%。仍然遵守雌雄各半或雌雄兼取的原则。当预试中发现化学物的毒性有明显的性别差异时,则需要选用雌、雄两种性别的动物分别进行试验,求出各自的LD50。
通过预试,找出受试化学物引起动物死亡的大致剂量范围,以此为依据设计正式试验的剂量和分组。
按下式设计剂量组:
式中:r—相邻两组剂量的比值,一般为1.2~1.5,
b—最低全致死剂量量,
a—最高不致死剂量,
n—设计的组数。
分组恰当与否也是确保实验结果准确的条件之一。因为组数过多,需要消耗较多的动物,还可能出现较大剂量组动物死亡率低于较小剂量组;组数过少,不能较精确求出LD50。
3、根据公比(r)计算各组剂量
各组剂量分别为:
第一组:a
第二组:a r
第三组:a r2
第四组:a r3
第五组:a r4
第六组:a r5
二、受试物溶液配制
1、溶剂的选择
毒理学试验中,常用的剂型有液体剂型、固体剂型。液体剂型中有溶液剂、混悬剂、乳化剂等。选择溶剂的原则是不与受试物发生化学反应,不改变化学物的毒性,故应根据受试物的理化性质,选择适当的溶剂。
一般而言,水溶性化学物可选择蒸馏水或生理盐水,以水为溶剂,既经济、方便、易吸收,又无毒副作用。脂溶性化学物多选用植物油,如花生油、橄榄油。不溶于水而溶于油的化学物常用吐温-80或吐温-60配制成乳化剂。既不溶于水又不溶于油脂的化学物可选择淀粉液、明胶液、羧甲基纤维素钠液(0.5-1% CMC)等助悬剂配制成混悬液。如用有机溶剂,实验动物应设溶剂对照组,有机溶剂所用比例不宜超过10%,溶解后,再用水稀释,必要时可加入增溶剂,如吐温-80、聚乙二醇等,以提高溶液剂的浓度。
2、配制方法
受试化学物的配制方法有等浓度稀释法和等容量稀释法。
等浓度稀释法 将受试物配制成一种浓度,不同剂量组实验动物单位体重所给受试物的体积不同,剂量越高,所用的体积越大;剂量越低,所用的体积越小。比如某受试物的试验剂量分别为100、200、400和800mg/kg,受试物配制成10 mg/ml,每组动物每10g体重分别给与0.1、0.2、0.4和0.8 ml。
等容量稀释法 将受试物配制成不同浓度,不同剂量组实验动物单位体重所给受试物的体积相同,剂量越大,受试化学物配制的浓度越高。上例中,若实验动物按0.2ml/10g b.w容量灌胃,则应配制成4个不同浓度,即5mg/ml、10mg/ml、20mg/ml和40mg/ml。
灌胃体积依所选用的实验动物而定,一次灌胃的体积为:小鼠0.1~0.4ml/10g b.w,每只不超过1ml;大鼠0.5~1ml/100g,每只不超过4ml;家兔在5ml/kg之内;犬不超过50ml/kg;
为避免操作误差,等容量稀释的传统方法常采用1∶K系列稀释法。该法操作简便、浓度精确、节约受试化学物。
确定各剂量组所需受试液浓度
如已知最高剂量组剂量为2000mg/kg b.w.,小鼠按等容量方法给予受试药液,即0.2
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