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实用标准文案 精彩文档 分子生物学综合性实验 脂肪酶基因克隆 表达 纯化（上游） 班 级： 生技142 姓 名： 王稳稳 学 号：组 号： 4 小组成员： 陈思园、王艳、肖杰 指导老师： 吴海珍、李鹏飞 华 东 理 工 大 学 应用生物学系 目 录 摘要 1 HYPERLINK \l 前言 HYPERLINK \l 实验原理 实验原理 4 目的基因 载体质粒 表达宿主 1.1外源基因的制备和载体质粒的制备 1.1.1 PCR 1.1.2 PCR产物纯化 1.1.3 质粒抽提 1.2外源片段与载体片段的酶切和回收 1.2.1 DNA酶切 1.2.2 DNA回收 1.2.3 DNA连接 1.3感受态细胞的制备与转化 1.3.1 感受态细胞制备 1.3.2 感受态细胞转化 1.4重组子的鉴定 1.4.1 菌落PCR 1.4.2 质粒快抽 1.4.3 酶切鉴定 1.5重组菌表达 1.5.1 RNA抽提 1.5.2 RT 1.6重组菌的转录和蛋白质表达分析 1.6.1 SDS电泳 2 HYPERLINK \l 材料与方法 材料与方法 10 2.1外源基因的制备和载体质粒的制备 10 2.1.1 PCR 2.1.2 琼脂糖凝胶电泳 2.1.3抽取质粒 2.2外源片段与载体片段的酶切和回收 12 2.2.1 预酶切 2.2.2 大量酶切 2.2.3 酶切产物电泳及切胶回收 2.2.4 载体、外源连接 2.3感受态下拨的制备和转化 14 2.3.1 连接分析 2.3.2 感受态制备 2.3.3 感受态转化 2.4重组子的鉴定 2.4.1 菌落PCR 2.4.1 快抽质粒和酶切 2.5重组菌的表达 2.5.1 总RNA抽提 2.5.2 RT 2.5.3 RT-PCR 2.6重组菌的转录和蛋白质表达分析 2.6.1 蛋白样品提取 2.6.2 SDS 3 HYPERLINK \l 结果与分析 结果与分析 23 3.1外源基因的制备和载体质粒的制备 23 3.2外源片段与载体片段的酶切和回收 24 3.3感受态下拨的制备和转化 26 3.4重组子的鉴定 28 3.5重组菌的表达 3.6重组菌的转录和蛋白质表达分析 4 HYPERLINK \l 讨论 讨论与总结 37 HYPERLINK \l 参考文献 参考文献 38 摘要： 大肠杆菌碱性磷酸单酯酶基因的克隆、表达实验运用了PCR的手段对目的基因进行克隆，经过Nde1和BamH1两种限制性核酸内切酶酶切后连接，经Ca2+ 介导转化大肠杆菌细胞。以卡那霉素作为筛选条件，筛选出重组子，作为生产碱性磷酸单酯酶的基因工程菌株。 1．实验原理 目的基因：AFL-1基因表达的蛋白为脂肪酶（Lipase，甘油酯水解酶），其隶属于羧基酯水解酶类，能够逐步的将甘油三酯水解成甘油和脂肪酸。是一类具有多种催化能力的酶，可以催化三酰甘油酯及其他一些水不溶性酯类的水解、醇解、酯化、转酯化及酯类的逆向合成反应，除此之外还表现出其他一些酶的活性，如磷脂酶、溶血磷脂酶、胆固醇酯酶、酰肽水解酶活性等。本实验所使用的脂肪酶编码基因来自于烟曲霉菌（Aspergillus fumigatus）。 载体质粒：pET-28a-c(+)载体大小约5.6kb，含有Kan抗性基因，载体上有多个克隆位点，本实验选用的酶切位点为NdeI和BamHI。含有噬菌体 T7 强启动子。 表达宿主：用于高效表达克隆于含有噬菌体T7启动子的表达载体（如pET系列）的基因。T7噬菌体RNA聚合酶位于λ 噬菌体DE3区，该区整合于BL21的染色体上。pET-28a的T7 强启动子驱动外源基因表达所需的T7 RNA聚合酶由宿主细胞BL21(DE3)提供，由 lac操纵子控制T7 RNA聚合酶的表达，诱导剂是IPTG。 1.1外源基因的制备和载体质粒的制备 1.1.1 PCR原理 PCR基本原理:类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。PCR由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成：①模板DNA的变性：模板DNA经加热至97℃一定时间后，模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA发生解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；②模板DNA与引物的退火(复性)：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至57℃左右，引物与模板DNA单链的根据碱基互补配对原则结合；③引物的延伸：DNA模板与引物结合物在Taq DNA聚合酶的作