副猪嗜血杆菌突变菌株构建与生物学特性研究.pptVIP

硕士论文答辩 副猪嗜血杆菌突变菌株的构建及生物学特性的研究 Construction of Haemophilus Parasuis Mutant and Research on Mutant’s Biological Characterization 报告内容 1.文献综述 2.目的和意义 3.技术路线 4.结果与分析 5.讨论 6.小结 7.致谢 1.文献综述 1.1副猪嗜血杆菌的研究进展 1.1.1病原特征 副猪嗜血杆菌(Haemophilus parasuis, Hps)属于巴斯德菌科嗜血杆菌属，是一种没有运动性的小型多形态杆菌。 1910年由德国科学家Glasser首次描述 1922年由Schermer和Ehrlich首次分离 Glasser’s病曾一度被认为是由应激所引起的散发性疾病,后来才被证实是由副猪嗜血杆菌所引起。 NAD依赖 典型的“卫星生长”现象，不溶血。 1.1.1病原特征 Hps的血清型复杂多样： 按琼脂扩散血清分型方法, 可将副猪嗜血杆菌分为15个血清型，另有20% 以上的分离株血清型不可定 1.1.2致病性和毒力 只感染猪，可以影响从2周龄仔猪到4月龄的青年猪，主要在断奶后和保育阶段发病，通常见于5~8周龄的猪，发病率一般在10％~15％ ，严重时死亡率可达50％。 临床症状：主要表现为发热、咳嗽、呼吸困难、消瘦、跛行、共济失 调和被毛粗乱等 主要剖检病变：胸膜炎、肺炎、心包炎、腹膜炎、关节炎和脑膜炎等。此外，副猪嗜血杆菌还可引起败血症，并且在急性感染后可能留下后遗症，即母猪流产、公猪慢性跛行。 1.1.2致病性和毒力 可能影响Hps毒力的因素：荚膜、纤毛、外膜蛋白(OMP)、神经氨酸酶 各血清型菌株之间的致病力存在极大的差异： 血清l、5、10、12、13、14型毒力最强，患猪归于死亡或处于濒死状态 血清2、4、8、15型为中等毒力，患猪死亡率低，但出现败血症状，生长迟滞； 血清3、6、7、9、11型感染猪后没有明显临床症状。 1.1.3 预防与免疫 控制方案：疫苗接种（商品疫苗，自家疫苗） 抗菌素处理 加强饲养管理 1.2 突变转座技术的研究进展 转座子（transposon）是由Barbara McClintock在1951年在玉米中发现 是生物体基因组上的可移动的遗传元件，在细菌和各类真核生物中存在，可以通过切割、重新整合等一系列过程从基因组的一个位置“跳跃”到另一个位置 。 1.2.1转座子在生物学研究中的应用 转座子的特征： (1)转座子因为具有可选择的抗性标记而容易在体内鉴定突变； (2)经转座子诱变的突变子含有已知的DNA片段，可以通过转座子序列的杂交来鉴定突变基因的位置； (3)经转座子诱变的突变体具有高度的极性，使得被诱变的基因以及同一操纵子内的下游基因完全丧失功能。 1.2.1转座子在生物学研究中的应用 主要用于基因功能的研究及蛋白质功能的研究 1.3 构建细菌突变株的技术 构建突变株的方法：自身突变、转座技术、化学因素(亚硝酸盐)和紫外线 GPS-M突变系统通过体外转座的方式将转座因子插入到目的DNA中 目的DNA：质粒、装配型质粒、细菌人工染色体（BAC）、纯化的染色体DNA 具有插入免疫性，在190kb内起作用 转座载体上带有Kan的抗性标记 2.研究的目的和意义 副猪嗜血杆菌是猪Glasser’s病的病原菌。目前，该病的发病率和死亡率均呈显著上升趋势，已给养猪业造成较大的经济损失。 传统的灭活疫苗只能提供针对同一血清型菌株的保护力，不能提供交叉保护力。 在其它许多细菌性传染病中，弱毒疫苗能预防不同血清型的感染，但是在Hps中尚未报道，如能通过转座技术来构建突变体库，从中发现有生物学意义的突变株，测定其免疫原性特征，可能为疫苗毒株的筛选或免疫原性基因的发现提供原始数据。 2.研究的目的和意义 在国内，由于本病为新发生的传染病，对其研究尤其是分子生物学的研究刚刚起步，对该病原菌的基因结构与功能的研究仍是空白。 本试验对转座技术在副猪嗜血杆菌突变体构建中的应用作了一些探索，对副猪嗜血杆菌的预防具有重要意义。 3 .技术路线 4. 结果与分析 4. 结果与分析 4.1 突变菌株的鉴定 4.1.1 突变菌株的抗性(Kanr)筛选 TSA(Kanr)琼脂平板上长出了543个转化子。菌落为光滑型，灰白色透明，直径大约0.5mm。 4.1.2 PCR扩增转座插入序列 4.1.2 PCR扩增转座插入序列 4.1.3 PCR扩增16S rRNA 4.1.4 毒力减弱突变菌株的初步筛选 表1 接种细菌后昆明鼠的死亡情况Table 1 The mo