微生物研究进展hapter5 分子生态学方法在环境微生物研究领域的应用.pptVIP

1、传统培养法的瓶颈 微生物多样性被用于监视和预测环境变化,也是新基因资源的重要来源。传统纯培养技术虽然已经帮助人们认识了很多微生物，创造了巨大的财富，但是由于 什么原因？ 各种环境中能纯培养的微生物种类非常有限，远远不能反映出自然界微生物多样性的丰度和范围。 2、微生物分子生态学的产生 3、微生物分子生态学的概念 1、研究路线 2、荧光原位杂交（ FISH ） 2、基于16S rDNA的指纹图谱法 方法： ⑴ 构建16S rDNA克隆文库 16S rDNA克隆文库数据分析 ⑵ 变性梯度凝胶电泳DGGE 16S rDNA的高可变区 DGGE的参数： 环境样品分析的流程 DGGE在微生物分子生态学中的应用 举例： RFLP（限制性片段长度多态性） T-RFLP（末端限制性片段长度多态性） 三、展望 存在的问题： 对微生物群落结构进行对比、分析或者跟踪监测。 通过扩增功能基因来研究功能基因及功能菌群的 多样性。 跟踪及检测细菌的富集和分离，评价不同的培养 条件对分离菌种的影响。 油藏古细菌 V3区 DGGE 图谱 胶浓度：10% 变性剂范围：40%-60% 电压：200V 运行时间：4.5h 优点： 缺点： 分辨率有限，复杂环境中（土壤或肠道），只能检测出优势菌。 一般只能分析500bp以下的片段。 PCR过程产生的异源双链和单链DNA会对分析造成偏差。 探针： 限制性内切酶： HindⅢ、BamHⅠ、 EcoRⅠ、EcoRV、XbaⅠ等。 优点 遍布整个基因组，数据多态信息量大 结果非常稳定，重复性好，探针多 缺点 技术复杂，周期长，费用高 检测中需放射性物质，限制了广泛应用 DNA量大，分析速度慢 每个荧光峰至少代表一个细菌或几个近缘的细菌 每个峰面积占总峰面积的百分数代表这个末端限制性片段的相对数量，可粗略认为与细菌在某一部位的微生态群落中的相对数量 T-RFLP的优点： 相对于其它方法，T-RFLP技术分析更为迅速，且结果可以数据的形式输出，因而在微生物群落的快速检测和分析中更有优势。 核糖体的拷贝数的不同会产生假阳性 操作简单、序 列多态性丰富 核糖体区间序列多态性 RISA 复杂群落多样性的低估、 影响因素多、 无法对微生物定性分析 方便快捷 分辨率高 灵敏度高 PCR扩增中所用引物的一端或两端带有荧光 标记 T- RFLP 对图谱进行定量化解析和进行群落 间的比较都十分困难 分辨率高 16S rDNA序列的差异， 限制性核酸内切酶酶切 后将得到长度与数量 不同的DNA片段 ARDRA 灵敏度和重现度差，150～400bp最佳 的分离效果 操作比较简便 价格低廉 长度相同但序列不同的单链DNA具有空间构 象上的差异 SSCP 同上 同上 温度梯度，利用不同序列结构的DNA，双链 具有不同的熔点温度Tm TGGE 分辨率低，被分析的片段不能大于400bp DNA片段纯化 后可以直接 用于测序 不同的变性剂浓 度，解链之后电泳速度将会急剧下降 DGGE 工作量大，成本高，不能对目标种群进行 原位和实时的检测 反映各种微 生物种类构成和亲缘关系 可以用来揭示 不同物种的 系统进化关系 16S rDNA 克隆 文库 基于 16S rDNA 的 方法 缺点 优点 原理 方法 类别 分析 方法 PCR反应本身的扩增和 偏差可能会产生假 阳性，不能对群落中 感兴趣的菌进一步研究 结果稳定 重复性好 灵敏度高 肠杆菌基因间重复共有序列在不同种属或 者同属的不同种微生物之间的拷贝数和定 位的差异引起两个ERIC之间序列的多态性 ERIC 重复性低 简单、迅速 利用随意设计的 非特异引物 RAPD 周期长，过程繁琐 信息量大 重复性高 序列差异引起限制性内切酶 酶切位点 的差异 RFLP 其它 分子 生物 学 方法 只能对特定类群的 微生物进行研究 操作简单， 可原位检测， 检测灵敏度高 人工合成的荧光或放射性标记探针与微生 物基因组杂交 FISH 影响杂交分析结果的 因素复杂，只能用来 检测事先已知其目标 基因序列的微生物 过程简单 避免PCR偏差 DNA的变性、复性及其 在复性过程中的碱基 配对原则、探针与 靶分子的特异性结合 核酸 探针 杂交 分子 杂交 缺点 优点 原理 方法 类别 分析 方法 * 第五章 分子生态学方法在环境 微生物研究领域的应用 农学系生物技术专业课程《微生物学研究进展》 一、微生物分子生态学的理论 二、微生物分子生态学的研究方法 三、展望 墨西哥湾“深海地平线”钻油台2010年4月20日爆炸起火沉没后不断漏油。钻油台所属的英国石油公司近日宣布又发现一处泄漏点，令漏油量多达每日5000桶，是原先估计的5倍，并