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第十八章 全自动DNA测序仪和蛋白质自动测序仪内 容 提 要第一节 全自动DNA测序仪一、工作原理 （一）双脱氧链末端终止法测序原理（二）新生链的荧光标记原理（三）荧光标记DNA的检测原理二、全自动DNA测序仪的结构与功能 （一）仪器的组成（二）仪器各组成部分的功能内 容 提 要三、全自动DNA测序仪的常见故障及维护（一）毛细管电泳型DNA测序仪的常见故障及维护（二）平板电泳型DNA测序仪的常见故障及维护四、全自动DNA测序仪的进展五、全自动DNA测序仪的主要应用第二节 蛋白质自动测序仪一、蛋白质测序仪的工作原理二、蛋白质测序仪的结构及其各部件的功能三、蛋白质测序仪的主要应用前 言了解生命现象、解释疾病的发生、诊断和治疗疾病，是生命科学的核心内容之一核酸和蛋白质是控制生命过程的两种重要大分子，其结构或功能异常是导致遗传性疾病或遗传相关性疾病的主要因素或相关因素，是生命科学研究的主要对象 前 言核酸分子携带生命活动的全套信息，其基本结构―核苷酸的线性排列构成它的一级结构 蛋白质的一级结构是指构成蛋白质的基本单位－氨基酸的排列顺序，研究蛋白质的一级结构是了解蛋白质功能的基础 第一节 全自动DNA测序仪 DNA测序 核苷酸序列早期：小片段重叠法 通过测定RNA序列来推测DNA序列 缺点：既费时又不准确20世纪80年代以后 ：DNA自动测序仪 Sanger双脱氧链末端终止法 Maxam-Gilber化学降解法 优点：操作简单、安全、快速、准确 一、全自动DNA测序仪工作原理 Sanger双脱氧链末端终止法 Maxam-Gilber化学降解法 都是根据在某一固定的点开始核苷酸链的延伸，随机在某一个特定的碱基处终止，产生A、T、C、G四组不同长度的一系列核苷酸链，在变性聚丙烯酰胺凝胶上电泳进行片段的分离和检测，从而获得DNA序列 双脱氧链末端终止法更简便和更适合于光学自动探测，故在全自动DNA测序仪中应用广泛 （一）双脱氧链末端终止法测序原理 利用DNA的体外合成过程－－聚合酶链反应（polymerase chain reaction, PCR） DNA聚合酶的催化以目的DNA为模板按照碱基互补配对原则在引物的引导下单核苷酸聚合形成新DNA链（一）双脱氧链末端终止法测序原理普通的PCR反应体系中，加入的核苷酸单体为 4种2’-脱氧核苷三磷酸（dATP，dCTP，dGTP，dTTP） 图18-1 dNTP结构示意图（一）双脱氧链末端终止法测序原理测序反应体系中，加入的核苷酸单体为 2’,3’-双脱氧核苷三磷酸 （ddNTP） 图18-2 ddNTP结构示意图（一）双脱氧链末端终止法测序原理 与dNTP相比，ddNTP在脱氧核糖的位置上缺少一个羟基，反应过程中虽然可以在DNA聚合酶作用下，通过其磷酸基团与正在延伸的DNA链的末端脱氧核糖-OH发生反应，形成磷酸二酯键而掺入到DNA链中，但它们本身没有-OH，不能同后续的dNTP形成磷酸二酯键，从而使正在延伸的DNA链在此终止。 （一）双脱氧链末端终止法测序原理 据此原理分别设计四个反应体系，每一反应体系中存在相同的DNA模板、引物、四种dNTP和一种ddNTP(如ddATP)，则新合成的DNA链在可能掺入正常dNTP的位置都有可能掺入ddNTP而导致新合成链在不同的位置终止。由于存在ddNTP与dNTP的竞争，生成的反应产物是一系列长度不同的多核苷酸片段。 TemplatePolymerasePrimerTerminatorGCAT（一）双脱氧链末端终止法测序原理dNTPs图18-3 双脱氧链末端终止法测序反应原理（1）A C T G G C C T A A T C G A G T C A G TT G A C C G G ATGCTGTTGACGGCACTTTCAGATAC（一）双脱氧链末端终止法测序原理图18-4 双脱氧链末端终止法测序反应原理（2）T（一）双脱氧链末端终止法测序原理图18-5 双脱氧链末端终止法测序反应原理（3）ACG（一）双脱氧链末端终止法测序原理图18-6 双脱氧链末端终止法测序反应原理（4）（一）双脱氧链末端终止法测序原理图18-7 双脱氧链末端终止法测序反应原理（5）（二）新生链的荧光标记原理早期采用同位素法标记新生链，因其具有放射性危害、背景高等缺点而很快被荧光染料标记法所取代荧光染料的荧光和散射背景较弱，提高了信噪比；它们的激发光谱较接近而发射光谱均位于可见光范围，且不同染料的发射光谱相互分开，易于监测，故在DNA自动测序中得到广泛应用 （二）新生链的荧光标记原理 荧光染料 标记法荧光标记引物法荧光标记终止底物法 单色荧光标记法多色荧光标记法 荧光标记引物法荧光标记终止底物法 （二）新生链的荧光标记原理 多