真题答题(大题须稍加整理).docVIP

DNA的半保留复制是生物进化和传代的重要途径。双链DNA在多种酶的作用下可以变性解链成单链，在HYPERLINK /search?word=DNA%BE%DB%BA%CF%C3%B8fr=qb_search_expie=utf8DNA聚合酶与启动子的参与下，根据HYPERLINK /search?word=%BC%EE%BB%F9fr=qb_search_expie=utf8碱基互补配对原则复制成同样的两分子挎贝。在 HYPERLINK /search?word=%BE%DB%BA%CF%C3%B8%C1%B4%CA%BD%B7%B4%D3%A6fr=qb_search_expie=utf8聚合酶链式反应实验中发现，DNA在高温时也可以发生变性解链，当温度降低后又可以复性成为双链。因此，通过温度变化控制DNA的变性和复性，并设计引物做启动子，加入HYPERLINK /search?word=DNA%BE%DB%BA%CF%C3%B8fr=qb_search_expie=utf8DNA聚合酶、dNTP就可以完成特定基因的体外复制。 PCR利用了DNA的热变性原理，通过控制温度来控制双链的解聚与结合，现在使用的PCR仪实质上也是一台能够自动调控温度的仪器。 PCR一般经历三十多次循环，每次循环可以分为三个基本步骤──变性、复性和延伸。 (!)变性（模板DNA解旋） 模板DNA经加热至90℃以上。一定时间后，使模板DNA双链解离，使成为单链，以便于它与引物结合，为下轮反应作准备。 (2)复性（退火） 模板DNA经加热变性成单链后，温度降到50℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合。 (3)延伸 DNA模板－引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下以脱氧核苷酸为原料，以母链为模板，按碱基互补配对的原则与半保留复制的原理，合成一条新的DNA链。 循环数 变性 复性 延伸 第一次（预变性） 94°C，30s － － 30次 94℃，20s 52℃，20s 72℃，20s 最后一次（保温） 72℃，30s (2)琼脂糖凝胶电泳 DNA在电厂作用下，可以由电源的负极向正极泳动，泳动的速度与DNA片段的长度成负相关，与电压强度成正比，因此可以分离不同长度的DNA。在有DNA marker（不同已知碱基对大小的DNA片段的混合物）的条件下，由于不同碱基大小的DNA片段在琼脂糖凝胶上涌动的速度不同，因此电泳完毕后会出现在胶块的不同位置。通过将扩增出的DNA片段与已知的条带做比较，可以大概推测出该片段的碱基对的大小。如果要进一步检测其大小，可以换另外规格的DNA marker 继续电泳。核酸荧光染料可以与DNA嵌合，一起电泳，DNA图谱观察仪可以激发特定的蓝色光源，荧光染料在该光照射下可见到荧光，荧光的亮度与DNA大小成正比。 三、实验仪器及试剂 7种PCR组分 微量可调移液器 离心管 PCR仪 水平电泳槽 电泳仪电源 紫外分光光度计 250ml锥形瓶(封口膜) 记号笔 卫生纸 四、实验步骤 1、DNA体外扩增 (1) 将所有试剂管瞬时离心一次（4000r/min,1min），使管壁没有残留药品，在引物 = 1 \* ROMAN I 和引物 = 2 \* ROMAN II的离心管内用移液器各加入40ul双蒸水（ddH2O），混匀后瞬时离心一次。所有的离心管都摆到双面板上。 (2)向装有Taq DNA 聚合酶的离心管按下表加入以下成分： 10x Buffer 50 μL MgCl2 50 μL dNTP mixture 20μL 上游引物(引物 = 1 \* ROMAN I) 25μL 下游引物(引物 = 2 \* ROMAN II) 25 μL 模板DNA 25 μL ddH2O 290μL 原有的Taq DNA 聚合酶有15ul，此时混合液体系共计500ul,此步骤由第一、二组同学合作完成。（在实验老师的监督指导下操作，确保此后其他同学的实验顺利进行） (3)共分25组，第一、二组的同学并入其他小组进行实验。每组取20ul的上述混合液于0.5ml的离心管中，加入15ul的液体石蜡封闭体系，以防止在加热过程中蒸发。 (4) 对自己组的离心管上进行标记之后，放到PCR仪上进行DNA扩增。 2、琼脂糖凝胶电泳检测DNA （1）用蒸馏水将电泳槽和梳子冲洗干净，放在水平桌面上，并架好梳子。 （2）配制浓度为1%（1 g/100 mL）的琼脂糖凝胶2块。在锥形瓶中，称取1g的琼脂糖粉，加入100ml 1x电泳缓冲液，用封口膜封住瓶口后在微波炉内加热，使琼脂糖粉熔化，然后冷却至60 ℃，倒入电泳槽中（每块胶50ml），插好梳子，待其凝固。（电泳槽首先用透明胶带将两端封住再进行倒胶） （3）待胶凝固后，去掉胶带纸，小心移去梳子，注意不要破坏加样孔。将倒胶槽至