dna氧化损伤修复基因hog1低表达细胞株的建立及其应用研究-劳动卫生与环境卫生学专业毕业论文.docx

四川大学博士学位论文 作者张遵真 目前，关于hOGGl基因与环境致癌物作用的报道还不多，研究的物质种 类也很有限。此外，有关hOGGl与氧化损伤和癌症的关系的研究结果也 不尽一致，有的研究显示外来化合物诱导DNA氧化损伤时，hOGGl表 达下降，酶活性降低，组织中8-OHdG增加；而有的报道则相反。目前， 国外正在从各个方面蓬勃开展其研究，国内的报道相对较少。本研究拟 采用核酶技术和分子克隆技术建立hOGGl基因低表达的细胞株，这将为 深入研究DNA氧化损伤和修复以及与癌症的关系提供一个十分有效的 毒理学实验工具。 核酶(ribozyme)技术属于反义核酸技术之一，是继基因克隆之后 的又一全新分子生物学技术。核酶是一类具有核酸内切酶活性、能序列 特异性地剪切mRNA的RNA分子，设计合理的核酶能与被选择的靶 mRNA片段特异结合，通过多种机制抑制或封闭目的基因的mRNA表达， 使其失去生物学功能。由于核酶所具有的独特优点，近10年来其研究进 展十分迅速，特别是在基因治疗领域报道甚多，而毒理学上的应用报道 极少。 全文共分四个部分，主要研究内容如下： 第一部分：hOGGl基因特异性锤头状核酶真核表达载体的构建和鉴 定。应用计算机软件模拟hOGGl的二级结构并辅助设计核酶，采用分子 克隆手段将核酶基因克隆到真核表达载体pcDNA3．1(+)上，构建hOGGl 特异性锤头状核酶真核表达载体pcDNA3．1(+)．RZ，并经酶切电泳和DNA 测序鉴定。 第二部分：hOGGl低表达细胞株的建立及鉴定。运用真核细胞转染 的方法，将核酶的真核表达载体pcDNA3．1(+)一Rz经FuGENE 6介导转染 人的肺腺癌A549细胞；G418筛选，Neo基因的逆转录．多聚酶链反应 (RT-PCR)扩增证实转染成功；RT-PCR半定量检测转染细胞与未转染 细胞中hOGGl的表达水平，了解核酶对靶基因的抑制效果。 第三部分：hOGGl低表达细胞株的生物学特性鉴定。通过观察转染 细胞的形态、生长特性、细胞周期、细胞基础凋亡率、细胞增殖指数、  四川大学博士学位论文 作者张遵真 软琼脂克隆形成率及超氧化物歧化酶(SOD)的活力等，了解hOGGl 低表达细胞的生物学特性，为应用奠定基础。 第四部分：低表达细胞株在DNA氧化损伤与修复、药物敏感性和放 射敏感??研究中的初步应用。用彗星试验比较重铬酸钾(K2Cr207)、过 氧化氢(H20z)、抗肿瘤药物阿霉素(ADM)和60Co-,／射线对转染细胞 (命名为A549．R细胞)和非转染细胞(即A549细胞)DNA氧化损伤与修 复的差异；MTT试验检测两种细胞在ADM和60co．丫射线处理后的细胞 存活率，流式细胞术检测细胞周期、细胞凋亡和细胞增殖指数的变化， 以了解hOGGl的低表达对细胞的药物敏感性和放射敏感性的影响。 主要研究结果如下： 1、应用计算机软件模拟hOGGl的二级结构并辅助设计了60bp的核 酶基因，采用分子克隆手段将核酶基因克隆到真核表达载体pcDNA3．1(+) 上，经酶切电泳和DNA序列测定证实核酶基因成功克隆到pcDNA3．1(+)， 从而构建了hOGGl特异性锤头状核酶真核表达载体pcDNA3．1(+)．RZ。 2、用FuGENE 6转染试剂将pcDNA3．1(+)．RZ转染人肺腺癌A549细 胞，通过G418筛选出阳性转染的细胞克隆， RT-PCR扩增Neo基因证明 质粒成功导入靶细胞。转染TpcDNA3．1(+)．RZ的A549．R细胞hOGGl的 mRNA表达下降，比未转染的A549细胞降低61．5％，说明核酶基因在细 胞内能够转录出核酶，并可有效抑制目的基因hOGGl的表达。 3、hOGGl低表达细胞株的生物学特性鉴定结果表明：在转染初期 转染了核酶基因的A549一R细胞形态发生了一定的变化，但这种变化与 hOGGl无关，且随时间的延长，两种细胞在形态上逐渐趋于一致。两种 细胞的生长特性(群体倍增时间、进入对数生长期时间等)、基础凋亡率、 细胞增殖指数和细胞周期各时相的分布均无明显差异。软琼脂克隆形成 试验中转染hOGGl核酶基因的A549．R细胞克隆形成数显著低于未转染 的A549细胞，而SOD活性则显著高于未转染细胞。 4、就损伤和修复相比，转染细胞和非转染细胞在修复方面的差异远 远大于损伤的差异。对于损伤，四种受试物(K2Cr207、H202、ADM、  四川大学博士学位论文 作者张遵真 60Co．g射线)仅在个别浓度或个别指标表现出A549．R细胞的敏感性大于 A549细胞；在修复方面，无论是修复的时间或，和修复的能力均表现出 A549一R细胞的修复远远低于A549细胞埘i式细胞术检测结果显示；ADM 和60co玎射线均可引起细胞GO／(?1期阻滞，细胞凋亡增加