第三章二维电泳的蛋白质三提取与样品制备.pptVIP

第三章 二维电泳的蛋白质提取与样品制备 制备目的 完全溶解 解离 变性 还原蛋白 选择细胞破碎方法、蛋白解聚、溶解方法、去污剂和裂解液的成分 样品制备原则 尽可能采用简单方法进行样品处理，以避免蛋白丢失 细胞和组织样品的制备应尽可能减少蛋白的降解，低温和蛋白酶抑制剂可以防止蛋白的降解 样品裂解液应该制备，并且分装冻存-80℃，勿反复冻融已制备好的样品 通过超速离心清除所有的杂质 加入尿素之后加温不要超过37℃，防止氨甲酰化而修饰蛋白 第一节细胞裂解方法 温和裂解方法 剧烈裂解方法 用蛋白酶抑制剂防止蛋白裂解 蛋白沉淀步骤 清除影响二维电泳图谱杂质 裂解液组分 一、温和裂解法 组成较简单样品 渗透裂解 血细胞、组织培养细胞 低渗溶液悬浮细胞 冻融裂解 细菌、组织培养细胞 液氮迅速冷冻细胞，随后在37 ℃融化，反复几次 去污剂裂解 组织细胞 溶解细胞膜、裂解细胞，释放内容物 酶裂解法 消化细胞壁 溶菌酶 细菌 纤维素酶、果胶酶 植物 溶细胞酶 酵母 在等渗溶液中处理细胞 二、剧烈裂解法 超声裂解法 细胞样品 通过切应力裂解细胞 迅速超声重悬细胞，并在冰上冷却 弗氏压碎器（French Pressure cell） 含有细胞壁的微生物 在高压下迫使细胞穿过小孔径而产生剪切力 研磨法 固体组织、微生物 冻存于液氮中，随后研磨成