CSPEG纳米载体介导Mcl1siRNA联合沙利铂治疗肝癌的实验研究.docx

优秀毕业论文 精品参考文献资料 原创性声明本人声明，所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工 原创性声明 本人声明，所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工 作及取得的研究成果。尽我所知，除了论文中特别加以标注和致谢的 地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包 含为获得中南大学或其他单位的学位或证书而使用过的材料。与我共 同工作的同志对本研究所作的贡献均己在论文中作了明确的说明。 储躲善牡 帆丛年』月且 学位论文版权使用授权书 本人了解中南大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有 权保留学位论文并根据国家或湖南省有关部门规定送交学位论文，允 许学位论文被查阅和借阅；学校可以公布学位论文的全部或部分内 容，可以采用复印、缩印或其它手段保存学位论文。同时授权中国科 学技术信息研究所将本学位论文收录到《中国学位论文全文数据库》， 并通过网络向社会公众提供信息服务。 作者签名：!罐y 日期：卫年』月旦日 博士学位论文 博士学位论文 中文摘要 摘要 目的： 设计与构建Mel．1 siRNA质粒，明确Mcl一1 siRNA对肝癌细胞的 治疗作用和CS．PEG纳米载体介导基因治疗的优势，通过体内外实验 探讨奥沙利铂联合Mcl．1 siRNA对肝癌的协同杀伤作用，从而为临床 治疗肝癌提供理论依据。 方法： 1．构建靶向Mcl一1 RNAi片段的pGCsi．H1／Neo／GFP质粒，并进 行酶切鉴定和测序分析。 2．通过接枝共聚法制备壳聚糖．聚7,--醇(cs—PEG)纳米粒，用基 因：纳米粒材料比l：5制备基因纳米复合物，通过其形态、粒径、 电位、载药量、包封率、基因保护实验考察载体的理化特性以及基因 转染效果。 3．利用脂质体或CS．PEG纳米粒为载体将Moll siRNA质粒转染 入肝癌细胞中，对细胞内Mel．1基因表达进行干扰。 4．逆转录多聚酶链反应(RT-PCR)法检测转染Mcl．1 siRNA质粒 后肝癌细胞中Mcl．1 mRNA的表达，Western blot法检测转染Mcl一1 siRNA质粒后肝癌细胞中Mcl．1蛋白的表达。 5．MTT法检测Mcl．1 siRNA、奥沙利铂或联合用药对人肝癌细胞 增殖抑制作用。 6．流式细胞仪分析Mel．1 siRNA、奥沙利铂对人肝癌细胞周期和 凋亡的影响。 博士学位论文 博士学位论文 中文摘要 7．Transwell侵袭实验检测Mcl．1 siRNA、奥沙利铂或联合用药对 人肝癌细胞的侵袭力变化。 8．建立肝癌动物模型，用基因纳米复合物作瘤内多次注射，对 比奥沙利铂腹腔注射或联合用药组，绘制肿瘤生长曲线，切取肿瘤检 测体积抑制率和瘤重抑制率，免疫组化染色观察肿瘤内部的Mcl．1蛋 白的分布情况，Western blot法检测肿瘤组织中Mcl．1蛋白的表达水 平。 结果： 1．重组质粒经酶切鉴定与测序证实构建成功，质粒在HepG2细 胞中的转染率为65．80+3．67％。转染48 h后Mcl．1 mRNA水平和蛋白 水平均明显低于空白对照组和阴性对照组(p0．01)，Mcl-1 mRNA的 抑制率为68．2％，其蛋白水平的抑制率为71．2％。 2．空白纳米粒粒径为68．9士12．3nm，粒度分布均匀，‘电位为 32士6．4mV。在基因：纳米粒为l：5(w／w)时制备的基因纳米复合物粒 径为1 1 1．4+1 6．9nm，(电位为7．5+6．4mV，包封率为86．8士9．7％，载药 量为31．2+5．3％，对基因有较好的保护作用。基因纳米复合物组最大 转染效率为转染后72h(81．39a：3．57％)，明显强于脂质体组且持续作 用时间长。转染后持续作用时间较脂质体和裸基因均要长，转染72h 后对Mcl．1 mRNA抑制率较两对照组明显增强。 3．MTT法检测结果显示不同的时间Mcl．1 siRNA对肝癌细胞均 有抑制作用，基因纳米复合物组细胞抑制率显著高于纳米粒组和对照 组(pO．01)，且与脂质体转染组相比作用时间越长(72h以上)抑 制效果越明显(pO．05)。奥沙利铂对肝癌细胞的抑制作用呈现出剂 Ⅱ 博士学位论文 博士学位论文 中文摘要 量、时间依赖性，其联合应用基因纳米复合物时