利用sir流na抑制nf.docx

利用siRNA抑制NF．KB 利用siRNA抑制NF．KB p65世白的表达对U型IfIL管内皮细胞激活的蟛响的研究 鬯史妊塑 中文提要 背景： 器官移植现在已经成为治疗终末期器官功能衰竭的有效手段，为缓解l临床同 种供体的不足．异种器官作为最可能的供体来源越来越受到重视。然而，异种器 官移植作为远缘移植，其面I临的排斥反应较同种移植更为强烈、复杂。目前，异 种移植面临的主要障碍是延迟性排斥反应，在这一过程中，由诱生抗体诱导的移 植物II型血管内皮细胞激活是异种移植物功能丧失的关键。本课题利用RNA干扰 (RNAi)技术特异性的抑制血管内皮细胞中核因子rd3(NF．rd3)的表达，研究小 干扰RNA(siRNA)对异种移植延迟性排斥反应中II型血管内皮细胞激活的抑制 作用，探讨RNA干扰技术在异种器官移植中的应用前景。 方法： 1．将鼠明小鼠(体徽20．259)颈椎脱臼处死，无菌状态下完整取出其胸、腹 主动脉，利用檀块法在含毒20％胎牛血清的DMEM螭蓁滚中进行小鼠动昧血镣内 爱缝鼹的爨代纛绩伐培养。餐耋稳差纛徽镜下露察海皮绥您懿形态稻生长姆豫， 进行血管肉皮细胞中Ⅷ因予相关抗原的检测鉴定。 2．设计并体外化学禽成小鼠NF．1国p65的siRNA；同时筛选对小鼠血管肉皮 缨燕(EOMA)寿较蓑转梁效率戆转絷试蘩，薯遴～步饶纯该转聚试裁在转繁，j、 鼠NF—r,B p65的siRNA时的转染条件。 3．将EOMA细胞分为四组：(1)空白对照缎(细胞内不热任何干扰瓯撩)； (2)瑗往对照缝(￡鏊震傣苓蒺謦siRNA)；(3)NF。r,B siRNA缰(镪憝转粢NF-r-2B s[RNA)，(4)scramble si烈A组(细胞转染scramble siRNA)。予转染前～天，在 24孔板中接种EOMA细胞，共12孔，加入不含抗生索的适量的DMEM培养液(含 10％，翡FBS)，转染鼓缀簸豹汇合瘦要迭磷50．70％。分亵在转染麓蕊24h、48h、 72h时以及采转染时(Oh)用TRIzol法提取相应各级细胞总RNA，行RT-PCR测 定细胞内NF-r．B p65 mRNA水平；同时提取各组细胞总蛋白，行WesternNot测定 各缝缨稳NF．r．B妫5蛋龟。 利用siRNA抑制NF．KB 利用siRNA抑制NF．KB p65缉白的表达对11型【恤管内皮细胞激活的影响的研究 中文提要 4．将细胞分为七组：A组：空白对照组(细胞不加任何干扰因素)；B组；阴 性对照组(只加入空的转染试剂)；C组：TNF组(20ngJml)；D组：siKNA组(细 胞转染NF—r．B p65的siRNA)：E组：scramble siRNA组(细胞转染scramble siRNA)； F组：TNF+siRNA组(细胞转染NF—KB p65的siRNA+TNF)；G组：TNF+scramble siRNA组(细胞转染scramble siRNA+TNF)。 按实验设计各组细胞分别进行相应的转染，24小时后在C组、F组、G组中 加入TNF—a(终浓度为20ng／m1)。于此后的Oh、2h、6h、12h、24h、48h分别提 取各组细胞总蛋白，行Western blot，测定各组细胞在不同时间点NF．心p65蛋白 表达变化。另外，于第Oh、6h、24h提取各组细胞总蛋白，对比各组细胞内NF．v．B p65蛋白表达的差异。 5．将EOMA细胞分为七组：A组：空白对照组(细胞不加任何干扰因素)；B 组：阴性对照组(只加入空的转染试剂)；C组：TNF组(20ng／m1)：D组：siRNA 组(细胞转染NF—KB p65的siRNA)；E组：scramble siRNA组(细胞转染scramble siRNA)；F组：TNF+siRNA组(细胞转染NF．rd3 p65的siRNA+TNF)；G组： TNF+scramble siRNA组(细胞转染scramble siRNA+TNF)。 转染24小时后，按分组在相应的细胞中加入丁NF．a(终浓度为20ng／m1)。于 此后6h提取各组细胞总RNA，行RT-PCR，检测各组细胞内E．selectin、ICAM．1、 VCAM一1、TF、IL．1的mRNA水平。 结粜： 1，檀块培养60小时左右在倒鬣箍微镜下观察可发现有内发细胞从组织块周 围移出，大约10天左农细胞开始融合成片，呈“铺路石样”。传代培养的细胞和 廉代形态穗馘，生长较怏，4．5天可以融合成单爱，大概传4代左右眩，细胞-开始 变形，脱落，不再继续艇长。诵因子福关抗原(vWF)染色，绷胞浆星黄褐魏着 色。 2．农多静转染试麴中LipofectamineTM2000慰小鼠EOMA缎飚具有较麓的转 染效率，经过优化萁