miR21通过RECK介导TGFβ1引起的肝卵圆细胞的上皮间质转研究.docxVIP

万方数据 万方数据 温州医科大学硕士学位论文 WB DNA mRNA siRNA ECM Westem Blot Deoxyribo Nucleic Acid Message Ribose Nucleic Acid Small interfering RNA extracellular matrix 蛋白免疫印迹 脱氧核糖核酸 信使核糖核酸 小干扰核糖核酸 细胞外基质 2 温州医科大学硕士学位论文中文摘要 温州医科大学硕士学位论文 中文摘要 目的：肝纤维化前期的研究表明与肝星状细胞的激活有关，现在表明上皮．间质 转化(epithelial．mesenchymal transition，EMT)也起着非常重要的作用。EMT表现 为上皮标志的蛋白标志物降低和间皮标志蛋白标志物的表达升高。microRNA是 一类含25个核苷酸左右的非编码RNA，通过调节基因表达与靶基因的mRNA的 3’．非翻译区(3’．UTR)特异性结合后，抑制其转录和翻译，在多种生物过程中发 挥重要作用。肝卵圆细胞(Hepatic oval cell，HOC)是肝脏的原始兼性多能干细 胞，肝卵圆细胞具备极强的体外增殖和分化能力，在肝脏严重损伤或者肝脏受到 肝毒性物质损伤时候，这时候卵圆细胞的增殖与分化来完成肝再生。 本研究的目的是探讨miR．21在大鼠肝卵圆细胞(WB．F344)EMT中的作用和机 理。 方法 1．TGF．131对大鼠肝卵圆细胞EMT的作用 用10ng／ml TGF．131刺激HOC 1、3、5、7天后，显微镜下观察细胞形态的变 化，western blot检测上皮标志蛋白E．cadherin和间皮标志蛋白(N．cadherin、 Vimentin)的表达。 2．TGF．131刺激miR-21的表达 用10ng／ml TGF—Dl刺激HOC 5天后，实时荧光定量PCR检测miR-21的表达 情况。 3．MiR．21介导了TGF．131对HOC的EMT作用 转染100 MOI miR-21抑制慢病毒(anti．miR-21)抑制miR．21的表达后，用实 时荧光定量PCR检测miR．21的表达情况。建立稳定的miR．21抑制慢病毒细胞 株后，用TGF．Dl刺激HOC 5天，western blot检测检测E．cadherin、N．cadherin 和Vimentin的表达。 4．MiR-21对大鼠肝卵圆细胞EMT的作用 用100 MOI miR-21增强慢病毒(pre．miR-21)转染HOC，用实时荧光定量 PCR检测miR．21的表达情况。建立稳定的miR-21增强慢病毒细胞株后，用 TGF．131刺激HOC 5天，western blot检测检测E．cadherin、N．cadherin和Vimentin 的表达。 5．RECK介导了大鼠肝卵圆细胞的EMT (1)TGF．131刺激细胞后，western blot检测蛋白RECK。 (2)用TGF．p1刺激己转染终浓度为100 MOI的miR-21抑制慢病毒的细胞5 天后，用western blot检测PTEN的表达量。 万方数据 万方数据 温州医科大学硕士学位论文(3)转染终浓度为100 温州医科大学硕士学位论文 (3)转染终浓度为100 MOI的miR-21增强慢病毒4天后，用western blot检 测I也CK的表达量 (4)用RECK siRNA转染大鼠肝卵圆细胞后，TGF．131刺激细胞5天。用western blot检测E．cadherin、N．cadherin和Vimentin的表达。 (5)用RECK siRNA转染大鼠肝卵圆细胞后，miR-21增强慢病毒转染HOC。 用western blot检测E．cadherin、N．cadherin和Vimentin的表达。 结果 1．TGF．131的刺激引起大鼠肝卵圆细胞发生EMT (1)TGF一131刺激细胞形态发生改变，由原先卵圆形变为细梭形样的成纤维细 胞状细胞。 (2)TGF-131刺激引起了上皮标志蛋白(E．钙粘蛋白)表达下降。 (3)TGF-131刺激引起了间质标志蛋白(N一钙粘蛋白、波形蛋白)表达上升。 2．TGF．Dl刺激大鼠肝卵圆细胞miR．21的表达：在TGF．131刺激5天后miR．21 的表达明显上升。 3．MiR-21介导了TGF．Bl对HOC的致EMT作用。 (1)转染miR．21抑制慢病毒稳定细胞株后，miR-21的表达明显下降。 (2)上皮标志蛋白(E．钙粘蛋白)较对照组表达升高。 (3)IN质标志蛋白(N．钙粘蛋白、波形蛋白)表达较对照组表达下降。 以上结果提示下调miR-21表达后，阻断了TGF．131致HOC的EMT作用。 4．miR-2 1转染直接刺激HOC发生EMT (