拮抗菌34-9的贮藏特性及其细胞形态系和调亡研究.docx

拮抗菌34-9的贮藏特性及其细胞形态和凋亡研究 摘 要 中国是世界第一大柑橘生产国，但采后果实腐烂造成的损失却相当严重。传统 化学杀菌剂虽然曾在全球范围内被广泛使用，但对其的滥用和误用已使得很多病原 茵产生了抗性，再加上它造成的环境污染和人们对健康问题的关注，迫使人们去寻 找一种能有效替代化学杀菌剂对抗采后病害的新方法。在此，生物防治剂为我们提 供了一个很好的选择。 柠檬形克勒克酵母(Kloechera apiculata)常被用来酿酒，但根据我们的研究， 这种酵母还具有生防功效。拮抗菌34．9是一株分离于柑橘果园、已被证明能很好地 保护柑橘果实免受病原菌危害的柠檬形克勒克酵母。本实验从三个方面入手，借助 扫描和透射电镜技术、脉冲电泳技术、TUNEL反应和其他荧光染料(如DHE、Annexin V-FITC及PI等)，分别探讨拮抗菌34．9在诱导剂存在条件下发生凋亡的情况以及菌 体发酵和贮藏过程中的细胞形态和凋亡特性。 1．乙酸作为一种抗微生物防腐剂，20 mM浓度就能显著抑制拮抗茵34．9的繁 殖，40 mM孵育3 h，培养物浓度几乎没有改变。40及60 mM乙酸诱导细胞发生凋 亡，典型特征包括：TUNEL呈阳性的DNA降解；磷脂酰丝氨酸(PS)外翻；DNA 片段化形成不同于哺乳动物凋亡细胞ladder结构的大片段，同染色质高度有序降解 相一致，且多形成SSBs且／或DSBs；ROS积累：长形线粒体裂解，形成无嵴的、 膨胀肿大的异常小线粒体；细胞核均一化程度降低，核膜逐渐消散等。 j 2．拮抗菌34．9发酵初期即代谢葡萄糖生产大量乙醇，推测该酵母具有Crabtree 效应，即细胞在有氧环境下利用葡萄糖进行酒精发酵而非进行菌体生长。解释了为 什么进行菌体制备时，即使给予充足的营养物质，其生物量也只能达到108／mL而很 难继续提高的原因。葡萄糖制细胞同化乙醇及乙酸，大量乙醇、乙酸的积累会影响 酵母细胞的代谢活性。故在制备34．9茵体的过程中，葡萄糖的浓度不是越高越好， 而应该考虑它在调节代谢流方面的特殊作用。单批发酵过程中，24及48 h处细胞凋 亡死亡的比例低，推测此时培养基中代谢产物积累量低，没有达到启动细胞凋亡的 浓度。对细胞提前进行酸适应训练，可降低乙酸的毒害作用，有效改善细胞存活率。 3．柑橘的贮藏环境极不利于酵母34．9的存活，贮藏初期即开始发生死亡。酵母 存活率低与营养物质匮乏有关，作为病原菌的天敌，拮抗菌的生存可能有赖于病原 菌的存在。这可能就是生防菌34．9拮抗机制之一。 关键词：柑橘；贮藏；柠檬形克勒克酵母；细胞程序性死亡；乙酸  华中农业大学201 l届硕士研究生学位论文 Abstract China is the largest citrus-producing country around world while the loss from post-harvest decay is considerable．Conventional chemical fungicides，which once was a worldwide use，has been increasingly curtailed bY the development of pathogen resistance to many key fungicides caused by its excessive use and misuse，less eco-friendly,and pubfic perception that they are harmful t0 human health and environment．Thus， alternative to conventional chemical fungicides for the control of citrus post-harvest diseases are urgently needexL Biological control agents(BCAs)herein give a promising choice． Kloechera apiculata is usually mentioned as a brewing yeast,yet,according tO our study,it also possesses the trait of citrus post-harvest diseases contr01．K apiculata strain 34-9，isolated from natural citrus garden,has been demonstrated the quality of effective protectio