HGF基促进内皮祖细胞增殖的体外分析.docxVIP

天津医科人学硕十学位论文中文摘要 天津医科人学硕十学位论文 中文摘要 目的 体外条件下从大鼠骨髓中分离出单个核细胞，使用专用的培养基使其向内 皮祖细胞(endothelial progenitor cells，EPCs)分化生长，并将HGF基因转染原代培 养的大鼠血管内皮祖细胞，观察转染后细胞上清液中HGF的表达及HGF基因对 原代培养血管内皮祖细胞增殖、迁移及血管形成能力的影响。 方法 1．取4．6周龄Wistar大鼠(120．1509)双下肢股骨及胫骨骨髓，利用密度梯 度离心法分离单个核细胞，并使用内皮系专用培养液EGM．2MV诱导培养，使 其分化为血管内皮祖细胞。通过倒置相差显微镜观察培养细胞的生长情况，通 过荧光显微镜观察细胞摄取DiL-acLDL，结合FITC．UEA．1，从功能角度鉴定细 胞，并通过流式细胞术动态测定细胞表面抗原CDl33、flk．1、VE．cadherin(CDl44) 及CD31进一步鉴定所培养细胞为血管内皮祖细胞。 2．提取和扩增pCMV-HGF质粒，以缺陷性腺病毒(Ad．GFP)为载体介导 HGF基因转染血管内皮祖细胞并计算转染效率；采用ELISA法检测转染后HGF 蛋白的表达情况；用MTT法检测HGF基因对EPCs增殖的促进作用；Transwell 检测细胞的迁移能力；3D培养法观察细胞体外血管形成能力。 结果 1．成功分离和培养出大鼠骨髓血管内皮祖细胞，并通过细胞功能检测和流式 细胞术检测表面抗原来鉴定。 2．成功将HGF基因转染大鼠骨髓血管内皮祖细胞，荧光显微镜下可见绿色 荧光蛋白的表达；在HGF转染组细胞培养上清中检测到HGF的表达，第1天、 2天、4天、7天、11天浓度分别为22．15士3．77 ng／ml、39．424-7．32ng／ml、 99．09-a：9．89ng／ml、311．87+26．56 ng／ml、224．72士20．91 ng／ml，而空载腺病毒组、阴 性对照组没有检测出HGF的表达；转染后HGF基因对原代培养的血管内皮祖 细胞生长有显著的促增殖作用，转染4天和7天，转染组血管内皮祖细胞增殖 明显加快，与空载腺病毒组和阴性对照组相比均有统计学意义(PO．05)；转染后 细胞迁移能力增强；3D培养可见血管样结构形成。 结论 1．体外条件下能够从大鼠骨髓中成功分离出单个核细胞并诱导培养出血管 天津医科人学硕+学位论文内皮祖细胞。 天津医科人学硕+学位论文 内皮祖细胞。 2．通过腺病毒介导，可成功的将HGF基因转染入大鼠血管内皮祖细胞，并且 在培养上清液中可检测到HGF蛋白，证实转染后的目的基因能够在细胞中有效 的表达并促进EPCs增殖、迁移及血管形成。为下一步利用该基因进行基因．干细 胞移植治疗肢体缺血性疾病提供实验基础。 关键词：肝细胞生长因子血管内皮祖细胞腺病毒转染细胞培养血管生 成 II 天津医科人学硕+学位论文Abstract 天津医科人学硕+学位论文 Abstract Objective Mononuclear cells were isolated from rats bone marrow,then used special Medium make them differentiating to endothelial progenitor cells(EPCs)；and hepatocyte growth factor(HGF)gene were transfected into primary cultured endothelial progenitor cells(EPCs)of rats in vitro．Then the HGF protein secreted in culture medium were measured and studying its effect on the proliferation、migration and an西opoiesis of EPCs． Methods 1．Bone marorw mononuclear celIs(BMMNCs)were obtained from bone marrow of 缅w Wistar rats(120—1 509)by flushing rat’S femur and tibia and were isolated by density gradient centrifugation．cultured in endothelial growth medium-2 supplied with recombined human VEGF,IGF,b—FGF,FBS and ascorbic acid(EGM-2MV)．The cells were observed