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第四节 基因工程菌培养与发酵 什么是基因工程菌？ 培养和发酵基因工程菌的目的是什么 最常用的基因工程药物表达系统是什么？ 基因工程菌的发酵受到哪些条件的影响？ 一、概念 工程菌是采用现代生物工程技术加工改造，被转入了外源目的基因的新型微生物 具有多功能、高效和适应性强等特点。 治理海洋石油泄漏 生产基因工程药物 培养和发酵的目的：外源基因能高水平表达，能获得大量外源基因产物 【其实是指蛋白质的产生，表现出对应的作用】 最常用的基因工程药物表达系统（工程菌体系） 大肠杆菌、酵母菌、哺乳动物细胞 二、工程菌生长繁殖需要的条件 ①良好的物理环境:主要有发酵温度、PH值、溶氧量等。 ②合适的化学环境:适宜工程菌生长代谢所需的各种营养物质的浓度,并限制各种阻碍生长代谢的有害物质的浓度 ??????  三、基因工程菌常用的发酵方法 1、批式培养　??? 指营养物和工程菌株一次加入进行培养,直到培养结束放出,中间除了空气进入和尾气排出、酸碱调解PH值外与外部没有物料交换。 传统的生物制品发酵多用此过程。 2、流加式培养　??? 是一种发酵过程中优化化学环境的一种有效方法,在批式培养基础上,改善批式培养过程中由于营养物质的消耗造成的重组细胞营养不足,调整了工程菌所处的生长环境,使工程菌一直处于最佳状态 五、 基因工程菌生长代谢的特点 菌体的生长通常用比生长速率来表示。 工程菌培养可通过选用不同的碳源控制补料和稀释速率等方法来控制菌体的生长。 大肠杆菌的蛋白/菌体量的比值是基本恒定的，因而菌体的生长速度反映了蛋白质的合成速度。 控制菌体的生长对提高质粒的稳定性、减少代谢副产物积累、提高外源蛋白产率有重要意义。 （一）菌体的生长与能量的关系 碳源物质是组成培养基的主要成分 当菌体生长所需能量大于菌体有氧代谢提供的能量时，菌体会产生乙酸，导致培养基的pH值下降，从而影响菌体的生长。 适当提高pH，可减少乙酸的抑制作用 分批培养中选择不同的碳源，连续培养中控制稀释速率等都能一定范围内控制菌体的生长，从而控制乙酸的产生，减少它的抑制作用。 加入蛋氨酸和酵母提取物都能减少乙酸的产生。 （二）菌体生长与前体供应的关系 在基础培养基中加入氨基酸（小分子前体）能使菌体比生长率提高，蛋白合成增加。 六、基因工程菌发酵 （一）基因工程菌的培养过程 ⑴通过摇瓶操作基因工程菌生长的基础条件 如温度、pH、培养基各种组分、碳氧比，分析表达产物的合成、积累对受体细胞的影响; ⑵通过培养罐操作确定培养参数和控制方案以及顺序。 菌种 一级种子摇瓶 二级种子罐培养 扩大培养 原料 发酵培养 灭菌 发酵生产 代谢产物分离 基配制 微生物工业发酵过程简图 （二）基因工程菌的发酵工艺 基因工程菌的发酵不仅涉及宿主、载体和克隆基因之间的相互关系还和环境有关。 工艺要求：外源基因既高效表达，又有利于产品分离纯化。 对发酵影响较大的几个因素有： ⒈培养基的影响 ⒉接种量的影响 ⒊温度的影响 ⒋溶解氧的影响 ⒌热诱导时机的影响 ⒍pH的影响 ⒈培养基的影响 　 培养基的组成既要提高工程菌的生长速率，又要保持工程菌的稳定性，使外源基因高效表达。 常用的碳源有：葡萄糖、甘油、乳糖、甘露糖、果糖等。 常用的氮源有：酵母提取液、蛋白胨、酪蛋白水解物、玉米浆、氨水、硫酸铵、氯化铵等。 还有无机盐、维生素等。 不同的碳源对菌体的生长和外源基因表达有较大的影响。 使用甘油菌体得率较大，而使用葡萄糖菌体产生的副产品较多 在氮源中，酪蛋白水解物有利于产物的合成与分泌。 无机磷在许多代谢反应中是一个效应因子，磷浓度不同，影响菌体生长。 ⒉接种量的影响 接种量是指移入的种子液体积和培养液体积的比例。 接种量的大小影响发酵的产量和发酵周期。 接种量小，菌体延迟期较长，使菌龄老化，不利于外源基因表达。 接种量大，可缩短生长延迟期，菌体迅速繁衍，很快进入对数生长期，适于表达外源基因。 接种量过高，使菌体生长过快，代谢物积累过多，反而会抑制后期菌体的生长。 ⒊ 温度的影响 温度对基因表达的调控作用发生在复制转录翻译和小分子调节分子的合成等水平上。 温度影响各种酶的反应速度，改变菌体代谢产物的