变性高效液相色谱及其在微生物领域的应用.ppt

DHPLC分析图谱 灵敏度实验 PCR-DHPLC 可检测至产气荚膜梭菌标准菌株的10-8浓度梯度，即检测灵敏度可相当于约102~ 103个基因拷贝。 谢谢！ 变性高效液相色谱技术 及其在微生物领域的应用 变性高效液相色谱技术简介 发展史和基本原理 技术特征和影响因素 变性高效液相色谱技术在微生物领域的应用 报告内容 变性高效液相色谱技术简介 概念： 变性高效液相色谱法(denaturing high performance liquid chromatography，DHPLC)是在接近DNA解链温度条件下进行的离子对反相色谱分析法。由于主要影响因素为环境温度，因此也称作温度调控异源双链分析法(temperature modulated heteroduplex analysis，TMHA)或温度调控高效液相色谱法(temperature modulated high performance liquid chromatography，TmHPLC)。 最先由美国Stanford大学Oefner及Underhill等在1995年提出，现已有公司生产出商业化的检测仪器。目前全球使用最多也最易操作的是美国Tansgenomic公司开发的WAVE核苷酸片段分析系统。 变性高效液相色谱技术简介 原理： 变性高效液相色谱法也叫温度调控高效液相色谱法，目标核酸片段通过PCR扩增后，将温度升高使DNA片段开始变性, 则部分变性的DNA可被较低浓度的乙腈洗脱下来。由于异源双链(错配的) DNA与同源双链DNA的解链特征不同，在相同的部分变性条件下，异源双链因有错配区的存在而更易变性，被色谱柱保留时间短于同源双链先被洗脱下来，从而在色谱图中表现为双峰或多峰的洗脱曲线，此即DHPLC检测的基本原理。 工作温度( 柱温) 是决定DHPLC 敏感性的最关键因素 取样 PCR扩增 DHPLC分析 分析报告 电泳分析 分析报告 PCR-DHPLC的分析流程图 PCR产物电泳分析流程图 变性高效液相色谱技术简介 发展史： 1995年美国Stanford大学Oefner及Underhill等提出概念，现已有公司生产出商业化的检测仪器。DHPLC技术的迅速发展得益于新型柱填料的不断出现。目前，应用于DHPLC 的色谱柱有以下3 类： 1）苯乙烯、二乙烯苯单体、引发剂和致孔剂等混合物在石英毛细管内采用原位合成方法制备成的整体柱(monolithic column）。 2）使用315μm 硅胶表面键合直链硅烷固定相作为填料的Zorbax Eclipse dsDNA 分析柱(Agilent公司)。 变性高效液相色谱技术简介 3）使用2-3μm无孔多苯乙烯-二乙烯基苯（PS/DVB）共聚物微球，表面键合C18固定相作为填料的DNASep分析柱(Transgenomic 公司） 填料特点：热稳定性好、耐高温的PS/DVB微粒可保证分析结果的准确性和重复性。利用离子对反相液相色谱模式分离核苷酸，实现梯度洗脱条件下双链DNA(dsDNA) 片段的尺寸依赖性分离。可以连续进样分析超过6 000 次，无须再生。 目前全球使用最多的是美国Transgenomic公司开发的WAVE 核苷酸片段分析系统, 它通过一个独特的DNA色谱柱DNASep柱进行核酸片段的分离和分析。 DHPLC的优缺点 （1）优点 DHPLC具有检测效率高，对未知样品的准确率可达95%以上。该技术具有完全自动化、灵敏度高、经济等优点，可以大大节省工作量，降低检测周期，已经在实际工作中得到了广泛应用。 （2）缺陷 DHPLC检测对所用试剂和环境要求较高，容易产生误差，不能检测出纯合突变。 DHPLC的三种工作模式 （1）在核酸非变性条件下，即50℃下，能够进行DNA片段大小的分析、分离不同大小DNA的片段、PCR质量监测、LOH、MSI 等分析检测，还可以纯化、收集DNA、cDNA片段。 2）核酸部分变性条件下，即52~78 ℃下，可检测单碱基DNA突变和单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphisms，SNP）。 3）在双链核酸分子完全变性条件下（78~80 ℃ ），可用于对寡核苷酸、单链DNA、RNA的分离、纯化、收集等工作。 DHPLC在微生物领域的检测主要在第一种和第二种模式下工作。 DHPLC的三种工作模式示意图 变性高效液相色谱技术简介 DNASep色谱柱的分离机制： DNASep色谱柱填料PS/DVB共聚物微球是疏水电中性的，不与核酸分子发生直接反应。三乙基铵醋酸盐( TEAA ) 是一种离子对试剂，是疏水性的、带正电荷，既能与核酸主链上的磷酸基团的负电荷反应，同时又与固定