5连接2史011年分子生物学实验.pptVIP

电泳分析定量计算定量结果：确认回收片段，测定浓度并计算回收量。 制胶: 四人一块胶，1%琼脂糖凝胶，20ml 上样电泳: 1. Marker 5uL （0.75ug） 2. 5.3Kb 2uL 3. 0.7Kb 4uL （注意：样品加入10x loading buffer混匀后再上样) DNA连接酶 将具有相同粘性末端或平端的DNA分子连接起来。 DNA连接酶只能作用于双链DNA分子而不能将二个单链DNA分子连接。 T4噬菌体DNA连接酶连接带粘性末端DNA分子的效率远高于连接平末端的DNA分子 特点： 催化DNA 5’磷酸基与3’羟基之间（切口）形成磷酸二酯键。切口(nick)：DNA分子糖-磷酸主键的破坏。缺口(gap)：DNA分子中核苷酸缺失。 DNA连接酶： T4噬菌体DNA连接酶（可连接平末端双链DNA） 大肠杆菌DNA连接酶 连接酶单位： Weiss单位（ppi单位）：37?C、20分钟内将1nm的32P从焦磷酸根上置换到ATP分子上. １个Weiss单位相当于60个粘端单位 反应温度：最佳温度37°C