哺乳动物dna册的快速分离与pcr扩增111.pptVIP

二、实验原理 1、哺乳动物组织DNA的提取：在EDTA（鳌合二价阳离子以抑制DNase）存在的情况下，用蛋白酶K消化真核细胞或组织，用去垢剂如SDS溶解细胞膜并使蛋白质变性。核酸通过有机溶剂进行抽提纯化。污染的RNA通过RNase消化去除。根据本方法制备的哺乳动物DNA约20～50 kb，适于作PCR反应的模板。DNA产量在0.5～3.0μg/mg组织之间。 2、多聚酶链式反应(polymerase chain reaction)简称ＰＣＲ技术：ＰＣＲ技术实际上是在模板ＤＮＡ， 引物和４种脱氧核苷酸存在的条件下依赖于ＤＮＡ聚合酶的酶促合反应，ＰＣＲ技术的特异性取决于引物和模板ＤＮＡ结合的特异性。 反应分三步：①变性（denaturation）；②退火（annealing）；③延伸（ex tension），反应过程见图。 模板DNA在94℃条件下变性形成单链； 在55℃条件下根据目的基因两侧序列设计的引物分别与其同源序列结合；70℃下在耐热性DNA聚合酶Taq 酶催化下， 在４种dNTP存在条件下延伸形成双链。完成一次循环。 接着又以新合成的DNA为模板进行同样反应，如次往复循环30次，由于每次循环目标DNA都以２n次幂扩增，30次循环后目的DNA的量增加106～7倍。成功的PCR反应要求反应有很好的特异性，和相当的扩增效率。 要达此目的PCR反应要注意以下问题： ①、