2018年蛋白质变复性.docVIP

蛋白质变复性 　　变复性的过程 　　E.coli 中表达的蛋白常常以包涵体的形式沉积于细胞内,表现为无活性的不溶性聚集物。 　　生产研究中为了得到较高的目的蛋白的表达量，通常会采用较强的启动子(如λPL 、T7 或串联启动子) ,使外源基因可在胞内获得高效表达,一般占细菌总蛋白的10 %～50 %. 然而胞内表达的最大问题是产物形成不溶性的包涵体,虽然这可为后续的分离纯化带来方便,但包涵体必须经过体外复性才有可能获得生物活性 .绝大部分高表达的重组蛋白质往往聚集成不溶的、无活性的包涵体形式, 极大地影响到后续的结构分析和活性研究工作, 开展对这些包涵体的复性工作已成为一个重要的研究方向。 　　包涵体是由蛋白质折叠中间体的聚集而形成的,任何影响中间体稳定的因素(如pH 值、离子强度、温度等) 都可导致包涵体的形成. 　　包涵体形成原因 　　1. 表达量过高，研究发现在低表达时很少形成包涵体，表达量越高越容易形成包涵体。原因可能是合成速度太快，以至于没有足够的时间进行折叠，二硫键不能正确配对，过多的蛋白间的非特异性结合，蛋白质无法达到足够的溶解度等。 　　2. 重组蛋白的氨基酸组成，一般说来含硫氨基酸越多越容易形成包涵体。 　　3. 重组蛋白所处的环境，发酵温度高或胞内pH接近蛋白的等电点时容易形成包涵体。 　　4. 重组蛋白是大肠杆菌的异源蛋白，由于缺少真核生物中翻译后修饰所需酶类，致使中间 体大量积累，容易形成包涵体沉淀。 　　5. 有报道认为，丰富的培养基有利于活性蛋白质的表达，当培养条件不佳时，容易形成包涵体。 　　蛋白复性的必要性 　　细胞中的生物学活性蛋白质常以可融性或分子复合物的形式存在，功能性的蛋白质总是折叠成特定的三维结构型。包涵体内的蛋白是非折叠状态的聚集体，不具有生物学活性，因此要获得具有生物学活性的蛋白质必须将包涵体溶解，释放出其中的蛋白质，并进行蛋白质的复性。复性过程是变性蛋白的重折叠过程。 　　对包涵体蛋白复性,应先对包涵体进行分离纯化及去折叠（即变性溶解) ,然后采用合适的复性方法促进变性，蛋白再折叠进而恢复活性. 　　一． 包涵体的分离纯化 　　①含包涵体的宿主菌细胞的破碎； 　　②将破碎液离心除去可溶蛋白（9000r 15min 4℃），获得包涵体； ③洗涤包涵体,以除去包涵体上粘附的杂质，如膜蛋白或核酸，应用洗涤液洗涤包涵体，通常用低浓度的变性剂,过高浓度的尿素或盐酸胍会使包涵体溶解，如2M尿素在50mM Tris pH7.0-8.5左右,1mM EDTA中洗涤，温和去垢剂TritonX-100等洗涤包涵体,然后离心（12000r 5min 4℃）取上清洗涤后包涵体的主要成分为聚合态的目的蛋白。 　　二． 包涵体的去折叠（即包涵体的溶解） 　　极端pH值、高温、去污剂、高浓度的无机盐或有机溶剂均可用于溶解包涵体。绝大多数是采用6 mol/ L 盐酸胍或8 mol/ L 脲并结合还原剂来溶解包涵体.高浓度的变性剂可能会严重破坏蛋白质的二级结构,产生不可逆变性,导致无法复性. 因此,包涵体溶解时要采用尽可能低的变性剂浓度。 　　三． 复性 由于包涵体中的重组蛋白缺乏生物学活性，加上剧烈的处理条件，使蛋白的高级结构破坏，因此重组蛋白的复性特别必要。 通过缓慢去除变性剂使目标蛋白从变性的完全伸展状态恢复到正常的折叠结构，同时去除还原剂使二硫键正常形成。一般在尿素浓度4M左右时复性过程开始，到2M 左右时结束。对于盐酸胍而言，可以从4M开始，到1.5M 时复性过程已经结束。 　　包涵体蛋白复性方法 　　稀释复性： 　　直接加入水或缓冲液，放置过夜，缺点是体积增加较大，变性剂稀释 　　速度太快，不易控制。目前稀释法主要有一次稀释、分段稀释和连续稀释三种方式。 　　透析复性：好处是不增加体积，通过逐渐降低外透液浓度来控制变性剂去除速度，有人称易形成无活性蛋白质聚体，且不适合大规模操作，无法应用到生产规模。 　　超滤复性：在生产中较多的使用，规模较大，易于对透析速度进行控制，缺点是不适合样品量较少的情况，且有些蛋白可能在超滤过程中不可逆的变性。 　　柱上复性：是最近研究较多并成功的在生产中应用的一种复性方法，包涵体蛋白变性后，在色谱柱上复性，大致可分成疏水柱复性及凝胶柱复性两类。其中的凝胶柱复性均是用Sephacry1S-100或Superdex75 等分子筛填料，柱较长（40cm-100cm不等）。相比稀释和透析两种方法，色谱柱复性回收率高（高达90%以上）、快速、易放大，样品稀释倍数小（一般五倍左右） 　　高蛋白质浓度下的复性：通常有两种方法，一是缓慢地连续或不连续地将变性蛋白加入到复性缓冲液中，使得蛋白质在加入过程中或加入阶段之间有足够的时间进行折叠复性；二是采用温度跳跃式复性，即让蛋白质先在低温下折