实验室常用分子生物学合集--精华版.doc

PAGE PAGE 40 一 细菌相关实验技术 1. 细菌分离鉴定 1.1沙门氏菌分离鉴定 1.1.1 食品样前增菌 取检样25g，加入225mL缓冲蛋白胨水于均质杯内。用均质器以8000-10000r/min打碎1min，于36±1℃培养4h(干蛋品培养18～24h)，取 10mL于100mL亚硒酸盐肮氨酸（SC）增菌液内，于36±1℃培养18～24h。 1.1.2 食品样细菌分离 取增菌液1环，划线接种于DHL琼脂平板，于36±1℃分别培养18～24h(DHL)或40～48h(BS)，观察平板上生长的菌落，沙门氏菌Ⅰ、Ⅱ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ和沙门氏菌Ⅲ 非食品样直接取棉拭子在DHL琼脂平板上划线即可。表1　沙门氏菌属各群在各种选择性琼脂平板上的菌落特征 选择性琼脂平板 沙门氏菌Ⅰ、Ⅱ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ 沙门氏菌Ⅲ（即亚利桑那菌） DHL琼脂 无色半透明；产硫化氢菌落中心带黑色或几乎全黑色 乳糖迟缓阳性或阴性的菌株与沙门氏菌Ⅰ、Ⅱ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ相同；乳糖阳性的菌株为粉红色，中心带黑色 a) 生化试验: 自选择性琼脂平板上直接挑取数个可疑菌落，分别接种三糖铁琼脂。在三糖铁琼脂内，肠杆菌科常见属种的反应结果见表2。 表2　肠杆菌科各属在三糖铁琼脂内的反应结果 斜面 底层 产气 硫化氢 可能的菌属和种 - + +/- + 沙门氏菌属、弗劳地氏柠檬酸杆菌、变形杆菌属、缓慢爱德华氏菌 + + +/- + 沙门氏菌Ⅲ、弗劳地氏柠檬酸杆菌、普通变形杆菌 - + + - 沙门氏菌属、大肠埃希氏菌、蜂窝哈夫尼亚菌、摩根氏菌、普罗菲登斯菌属 - + - - 伤寒沙门氏菌、鸡沙门氏菌、志贺氏菌属、大肠埃希氏菌、蜂窝哈夫尼亚菌、摩根氏菌、普罗菲登斯菌属 + + +/- - 大肠埃希氏菌、肠杆菌属、克雷伯氏菌属、沙雷氏菌属、弗劳地氏柠檬酸杆菌 说明：在三糖铁琼脂内只有斜面产酸并同时硫化氢(H2S)阴性的菌株可以排除，其他的反应结果均有沙门氏菌的可能，同时也均有不是沙门氏菌的可能。 在接种三糖铁琼脂的同时，再接种碱性蛋白胨水(供做靛基质试验)、尿素琼脂(pH7.2)、氰化钾(KCN)培养基和赖氨酸脱竣酶试验培养基及对照培养基各1管，于36±1℃培养18～24h，必要时可延长至48h，按表3判定结果。按反应序号分类，沙门氏菌属的结果应属于A1、A2和B1，其他5种反应结果均可以排除。表3　肠杆菌科各属生化反应初步鉴别表 反应序号 硫化氢 靛基质 尿素 氰化钾 赖氨酸 判定菌属 A1 + - - - + 沙门氏菌属 A2 + + - - + 沙门氏菌属（少见）缓慢爱德华氏菌 A3 + - + + - 弗劳地氏柠檬酸杆菌、奇异变形杆菌 A4 + + + + - 普通变形杆菌 B1 - - - - - - - - + - 沙门氏菌属、大肠埃希氏菌、甲型伤寒沙门氏菌、鸡沙门氏菌、志贺氏菌属 B2 - - + + - - - - + - 大肠埃希氏菌、志贺氏菌属 B3 - - - - +/- + + + + - 克雷伯氏菌族各属阴沟肠杆菌、弗劳地氏柠檬酸杆菌 B4 - + +/- + - 摩根氏菌、普罗菲登斯菌属 反应序号A1：典型反应判定为沙门氏菌属。如尿素、KCN和赖氨酸3项中有1项异常，按表4可判定为沙门氏菌。如有2项异常，则按A3判定为弗劳地氏柠檬酸杆菌。表4肠杆菌科各属生化反应初步鉴别表-2 尿素 氰化钾 赖氨酸 判定结果 - - + - + - - + + 甲型副伤寒沙门氏菌（要求血清学鉴定结果） 沙门氏菌Ⅳ或Ⅴ（要求符合本群生化特性） 沙门氏菌个别变体（要求血清学鉴定结果） 反应序号A2：补做甘露醇和山梨醇试验，按表5判定结果。 表5肠杆菌科各属生化反应初步鉴别表-3 甘露醇 山梨醇 判定结果 + - + - 沙门氏菌靛基质阳性变体（要求血清学鉴定结果） 缓慢爱德华氏菌 反应序号B1：补做ONPG。ONPG（+）为大肠埃希氏菌，ONPG（-）为沙门氏菌。同时，沙门氏菌应为赖氨酸（+），但甲型副伤寒沙门氏菌为赖氨酸（-）。 1.1.3 沙门氏菌PCR方法 a) 煮沸法提取基因组DNA模板 b) 引物设计 fliC-1: 5’-GGCTATTATGAAGTTTCCGTTG-3’ fliC-2: 5’-GGGCAGAAGTCAGGTTGTTTAC-3’ sefA-1: 5’-AATTGTGCGAATGCTAATAGTTG-3’ sefA-2: 5’-TGATACTGCTGAACGTAGAAGGTC-3’ c) 反应体系：单重和二重PCR体系的总体积均为30mL，其中包括：1×PCR反应缓冲液，dNTP 0.2mmol/L，引物各25 pmol/L，1.5U Taq plus聚合酶，3uL DNA模板。 d) 扩增条件：优化后的PCR反应程序为 94℃预变性5