实验一细胞培养技术1.pptVIP

实验一 细胞培养技术;一、定义： 细胞培养（cell culture）是指将动物组织或细胞分散成单个细胞，在模拟机体内的生长环境下使其继续生长增殖的过程。;1、美国生物学家哈里森于1907年采用盖片覆盖凹窝玻璃悬滴培养法将蛙胚的神经组织培养在淋巴液中，存活了几周，开创了细胞培养。 2、1923年，卡瑞尔发明了卡士瓶培养法，扩大了培养组织的生存空间。 3、1951年，厄尔利开发了动物细胞体外培养的培养基，动物细胞培养技术开始形成。 4、20世纪70年代，大规模微生物培养技术的出现，几乎代替了动物的细胞培养，但在生产过程中，出现了许多生物活性蛋白质只能在动物细胞中产生，因为原核细胞缺乏蛋白质转录后修饰能力，也不能将蛋白质产物自动分泌到细胞外。 5、20世纪80年代：基因工程技术和细胞融合技术迅速发展，能把特定的外源基因转染到动物细胞体内，使其得到高质量的表达。; 包括病毒疫苗，非抗体免疫调节剂，多肽生长因子，酶类，激素，肿瘤特异性抗原，单克隆抗体，病毒杀虫剂等。;1.培养细胞的生长方式 ①贴附生长： 必须贴附于支持物表面才能生长。见于各种实体瘤细胞。 ②悬浮生长： 于悬浮状态下即可生长，不需要贴附于支持物表面。见于各种造血系统肿瘤细胞。;2.每代贴附生长细胞的生长过程;2.每代贴附生长细胞的生长过程 ①游离期：细胞接种后在培养液中呈悬浮状态．也称悬浮期。此时细胞质回缩，胞体呈圆球形。一般维持10分钟至4小时。 ②贴壁期：细胞附着于底物上，游离期结束。细胞株平均在10分钟至4小时贴壁。底物：胶原、玻璃、塑料、其它细胞等。 ③潜伏期：贴壁后并不马上分裂而是有一个潜伏期，该期长短与接种量、细胞种类有关，一般为6至24小时。 ; ;2.每代贴附生长细胞的生长过程 ④对数生长期：细胞分裂旺盛，可持续3—5天，细胞接触汇合成片，肿瘤细胞或转化细胞可发生细胞堆积，正常细胞无此现象。 ⑤稳定期（平台期）：细胞达一定数量后，由于培养空间与营养物质有限，特别是代谢废物积累的不利条件下，细胞进入新生的细胞数等于死亡细胞数的动态平衡时间。 ⑥衰亡期：营养物的耗尽和有害物质的作用，细胞进入衰亡期，活细胞减少，死细胞增多。;;3.细胞的生长条件;五、实验准备工作;超净工作台;压力蒸汽消毒器——高压蒸汽灭菌锅;电热干燥箱;滤器及滤膜;;CO2培养箱;倒置显微镜;液氮罐;自动双重纯水蒸馏器 纯水仪;细胞培养板;细胞培养瓶;离心管;冻存管;2.常用器皿清洗 玻璃器皿用自来水浸泡、洗涤剂刷洗、烘干、浸酸（24小时）。 流动的自来水洗10遍，蒸溜水冲洗3次，三蒸水或纯净水洗1次，180℃干热灭菌4h-6h。 塑料及橡胶制品等，超声波清洗3次，121℃高压湿热灭菌15min,烘干备用。 ;3.细胞培养用液的配制 ①水：新鲜的三蒸水或去离子水 ②平衡盐溶液：无Ca2+、Mg2+的缓冲液 PBS：NaCl 8.0 g KCl 0.2 g Na2HPO4.H2O 1.56 g KH2PO4 0.20 加水至1000 ml;③消化液 胰蛋白酶作用于与赖氨酸或精氨酸相连接的肽健，除去细胞间粘蛋白及糖蛋白，影响细胞骨架，从而使细胞分离。 胰蛋白酶液浓度越高，作用越强，但超过一定限度会损伤细胞。 胰蛋白酶是一种黄白色粉末，用无Ca2+、Mg2+的PBS缓冲液配制常用的胰蛋白酶液浓度是0.25％。用滤器过滤除菌。 胰蛋??酶液消化时间：2-10分钟。 用含血清培养液可以终止其对细胞的消化作用。;④培养基;（2）合成培养基;在培养液配制后，培养液内常加适量抗菌素，以抑制可能存在的细菌的生长。 青霉素抑制细菌的细胞壁合成。 链霉素抑制细菌蛋白质的合成。 通常是青霉素和链霉素联合使用。培养基内青霉素、链霉素最终使用浓度为每毫升100单位。 ;六、细胞的培养方法;举例:采用组织块法培养小鼠心脏组织细胞;2.细胞传代培养;贴壁生长细胞传代方法;无菌室;着装;消化数分钟;中止消化、吹散细胞;细胞传代