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基因工程的基本操作程序主要包括四个呢基本步骤
人工合成 已知其序列 已知其mRNA 的序列 已知其翻译产物的氨基酸序列 1.利用大肠杆菌可以生产出人的胰岛素,联系前面有关细胞器功能的知识,结合基因工程操作程序的基本思路,思考一下,若要生产人的糖蛋白,可以用大肠杆菌吗? 有些蛋白质肽链上有共价结合的糖链,这些糖链是在内质网和高尔基复合体上加工完成的,内质网和高尔基复合体存在于真核细胞中,大肠杆菌不存在这两种细胞器,因此,在大肠杆菌中生产这种糖蛋白是不可能的。 2.β-珠蛋白是动物血红蛋白的重要组成成分。当它的成分异常时,动物有可能患某种疾病,如镰刀形细胞贫血症。假如让你用基因工程的方法,使大肠杆菌生产出鼠的β-珠蛋白,想一想,应如何进行设计? 寻根问底: (1)从小鼠中克隆出β-珠蛋白基因的编码序列(cDNA)。 (2)将cDNA前接上在大肠杆菌中可以适用的启动子,另外加上抗四环素的基因,构建成一个表达载体。 (3)将表达载体导入无四环素抗性的大肠杆菌中,然后在含有四环素的培养基上培养大肠杆菌。如果表达载体未进入大肠杆菌中,大肠杆菌会因不含有抗四环素基因而死掉;如果培养基上长出大肠杆菌菌落,则表明β-珠蛋白基因已进入其中。 (4)培养进入了β-珠蛋白基因的大肠杆菌,收集菌体,破碎后从中提取β-珠蛋白。 * * 专题1 基因工程 基因工程的基本操作程序主要包括 四个基本步骤: 1)目的基因的获取 2)基因表达载体的构建 3)将目的基因导入受体细胞 4)目的基因的检测与鉴定 步骤一:目的基因的获取 目的基因是人们所需要转移或改造的基因, 获取目的基因是实施基因工程的第一步 。 如苏云金芽孢杆菌的抗虫基因,还有植物的抗病(抗病毒、抗细菌)基因、种子贮藏蛋白的基因,以及人的胰岛素基因、干扰素基因等。 目的基因的获得 从基因文库获得 基因文库 利用PCR技术扩增 人工合成 基因组文库 部分基因文库 已知序列 未知序列 哪些新技术能大大简化基因工程的操作技术? 1)DNA序列自动测序仪: 2)PCR技术: 对提取出来的基因进行核苷酸序列分析。 使目的基因的片段在短时间内成百万倍地扩增。 3)从基因文库中获取目的基因: 基因文库: 将含有某种生物不同基因的许多DNA片段,导入受体菌的群体中储存,各个受体菌分别含有这种生物的不同的基因,称为基因文库(gene library) 基因组文库: 基因文库中包含了一种生物所有的基因,这种基因文库叫做基因组文库. 部分基因文库: 基因文库中包含了一种生物的一部分基因,这种基因文库叫做部分基因文库. 用DNA重组技术将某种生物的总DNA用特定的限制性内切酶切割成一个个片段,然后将这些片段随机地连接在某些质粒或其他载体上,再将它们转移到适当的宿主细胞中,通过细胞的增殖而构成各个片段的无性繁殖系(克隆),当这些克隆多到可以包括某种生物的全部基因时,这一批克隆的总体就称为该种生物的基因文库。这一定义也适用于线粒体DNA和叶绿体DNA,分别称为某种生物的线粒体基因文库或叶绿体基因文库。为了有效地保存基因文库,可通过细菌在固体培养基上繁殖而使包含各个特定DNA片段的细菌增多。通过分子杂交的方法,可以筛选出包含有所需基因的DNA片段的细菌(或噬菌体)。经过扩增得到大量这样的细菌(或噬菌体),从中便可分离出所需基因的DNA片段。建立和使用基因文库是分离高等真核生物基因的有效手段,对于基因定位和基因工程的研究都很有用。 步骤二:基因表达载体的构建 1)用一定的限制酶切割质粒,使其出现一个切口,露出黏性末端。 2)用同一种限制酶切断目的基因,使其产生相同的黏性末端。 3)将切下的目的基因片段插入质粒的切口处,再加入适量DNA连接酶,形成了一个重组DNA分子(重组质粒) 目的基因与运载体的结合过程,实际上是不同来源的基因重组的过程。 常用的受体细胞: 有大肠杆菌、枯草杆菌、土壤农杆菌、酵母菌和动植物细胞等。 将目的基因导入受体细胞的原理 借鉴细菌或病毒侵染细胞的途径。 步骤三:目的基因导入受体细胞---转化 ①直接导入法有电击、显微注射、直接吸收、基因枪等方法。 (1)电击法:借助电击仪高压脉冲把目的基因打入宿主细胞。 (2)显微注射法:利用微量注射器在显微镜下直接把目的基因注入宿主细胞。 (3)直接吸收法:把目的基因和宿主细胞混在一起,让其吸收。 (4)基因枪法:在金属微粒上涂一层目的基因,然后发射到宿主细胞中。 ②间接导入法常用的载体是质粒、λ噬菌体、科斯质粒。 (1)质粒是细菌染色体DNA以外的环状双链DNA分子,它能自我复制,也可整合到细胞染色体DNA中与其一起表达。质粒通常还含有标记基因,这可以从
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