细胞培你养技术.pptVIP

主要内容 1.细胞原代传代培养概念及培养细胞的应用? 2.细胞培养的条件及环境 3.体外培养细胞类型及形态 4.细胞培养基本技术 5.细胞原代培养方法 6.培养细胞活性测定 7.细胞传代培养方法、细胞保存 细胞培养的条件及环境 无菌条件：净化工作室，风淋室，传递窗，高效过滤器，洁净层流罩，生物安全柜，超净工作台，紫外灯，电热干燥箱，滤器，高压灭菌器，抗生素 细胞生长条件：纯水蒸馏器，纯水仪，培养板，培养瓶，CO2培养箱，培养基，血清 细胞检测条件：倒置显微镜，酶标仪，微孔板震荡器，高速离心机，移液器 细胞保存条件：液氮罐 实验室安全： 超净工作台 超净工作台的工作原理是利用鼓风机驱动空气通过高效滤器除去空气中的尘埃颗粒，使空气得到净化。净化空气徐徐通过工作台面，使工作台内构成无菌环境。 紫外灯：紫外线消毒。主要用于培养室空气、操作台、塑料培养皿和培养板等表面消毒 紫外灯大约分为3种，分别是UVA、UVB和UVC。UVC是目前工业上所应用的紫外线杀菌灯(253.7nm)，是最常见的一种。高功率紫外线灯经8000小时，一般紫外线灯则在3000小时後功率会降至原来70％，这时就应该更换。国内的标准是：30W新灯管的辐射强度≥90uw/cm2为合格；使用中辐射强度应≥70uw/cm2。少于此标准就要更换。 滤菌器 　培养器材 CO2培养箱 培养细胞的生长条件 细胞培养用液的配制 　　水：新鲜的三蒸水或去离子水  合成培养基： 合成培养基是根据细胞生存所需物质的种类和数量，用人工方法模拟合成的。目前已设计出许多种培养基，如M199、MEM、RPMI-1640、DMEM等。 合成培养基主要成分是氨基酸、维生素、碳水化合物、无机盐和其它一些辅助物质。 优点：标准化生产，组分和含量相对固定。成本低。缺点：缺少某些成分，不能完全满足体外细胞生长需要。 抗菌素的使用： 在培养液配制后，培养液内常加适量抗菌素，以抑制可能存在的细菌的生长。 通常是青霉素和链霉素联合使用。培养基内青霉素、链霉素最终使用浓度为每毫升100单位。 庆大霉素：每毫升100单位——方便、广谱、稳定。 平衡盐溶液 主要用于作为稀释和灌注的液体，维持细胞渗透压，提供缓冲系统，使培养液的酸碱度维持在培养细胞生理范围内，提供细胞正常代谢所需的水分和无机离子等。 常用的有PBS，Hank’s等。 其它添加成分 缓冲系统，常用为HEPES（N’-2-hydroxy-ethylpiperazine-N’-ethanesulfonic acid），缓冲效能(pKa)在20℃时为7.55，37℃为7.31； HEPES不是起维持pH恒定的作用，而是起恒定和抵抗快速pH变化的，所以调整pH常常用NaHCO3溶液。 有机补充物，如丙酮酸钠， 谷胺酰氨等。 促细胞分裂因子，如生长因子类的FGF(成纤维细胞生长因子)，EGF(表皮生长因子)。 贴壁和铺展因子，如胶原蛋白，纤粘蛋白等。 可根据培养细胞的特殊要求进行添加。  （一）贴壁型：大多数培养细胞贴附生长，属于贴壁依赖性细胞，判断细胞形态时不能按照体内组织学标推判定，仅大致分成以下四型： -成纤维细胞型 -上皮型细胞 -游走细胞型 -多型细胞型 名称：凡在培养中形态与成纤维细胞类似的来源：由中胚层间充质组织起源的组织如：真正的成纤维细胞，心肌，平滑肌，成骨细胞，血管内皮 形态：似体内成纤维细胞的形态，胞体梭形或不规则三角形，胞质向外伸出2—3个长短不等的突起，中有卵圆形核 生长特点：排列成放射状，漩涡状，并不紧靠连成片，细胞—细胞接触易断开而单独行动，游离的单独的成纤维样细胞，常有几个伸长的细胞突起 2、上皮型细胞： 细胞呈扁平不规则多角形，中央有圆形核，细胞彼此紧密相连成单层膜。生长时呈膜状移动，处于膜边缘的细胞总与膜相连，很少单独行动。起源于内、外胚层的细胞如皮肤表皮及其衍生物、消化管上皮、肝、胰、肺泡上皮等皆成上皮型形态。 名称：仅形态上似体内，实际上不完全相同 来源：来源于外胚层、内胚层细胞, 如：皮肤及其衍生物,消化道，乳腺，肺泡, 上皮性肿瘤 形态：类似体内的上皮细胞扁平，不规则多角形，中有圆形核 生长特点：易相连成片，相靠—紧密相连—成薄层—铺石状生长时呈膜状移动，很少脱离细胞群而单个活动 3、游走细胞型： 呈散在生长，一般不连成片，胞质常突起，呈活跃游走或变形运动，方向不规则。此型细胞不稳定，有时难以和其他细胞相区别。 4、多型细