原核生物基因表达的调控启动子.PPT

第二节 外源基因在原核细胞中的表达 　四、常用大肠杆菌表达载体 　　1. 非融合型表达载体 　　　　pKK223-3 载体： 条件： 　　必须选择一个有lacI的宿主菌。 第二节 外源基因在原核细胞中的表达 　四、常用大肠杆菌表达载体 　　1. 非融合型表达载体 　　　　pKK223-3 载体： 　　结构组成： 　　1）强启动子: tac（trp-lac） 　　2）操纵基因：乳糖操纵子系统。 trp的-35区 lacUV5的-10区 lac操纵基因 第二节 外源基因在原核细胞中的表达 　四、常用大肠杆菌表达载体 　　1. 非融合型表达载体 　　　　pKK223-3 载体： 　　结构组成： 　　3）调节基因：宿主菌染色体上的乳糖操纵子系统。 如JM105菌。 　　4）终止子：rrnB的强终止子 　　　 　　　S-D序列和插入位点区： S-D 插入位点区 Lac I 第二节 外源基因在原核细胞中的表达 　四、常用大肠杆菌表达载体 　　1. 非融合型表达载体 　　　　pKK223-3 载体： 　　结构组成： 　　6）载体的其余部分：来自pBR322质粒。 　　7）表达诱导物：IPTG（乳糖的类似物，不会被降解） tac P Lac O S-D 插入位点区 rrnB T 宿主lac I 阻遏物 IPTG 第二节 外源基因在原核细胞中的表达 　四、常用大肠杆菌表达载体 　　2. 分泌型表达载体 　　　载体表达出的外源蛋白质与细菌的分泌信号肽连在一起，可被宿主菌分泌到细胞周质中。 如：pIN III系列： pIN III-comA1, pIN III-comA2, pIN III-comA3, 第二节 外源基因在原核细胞中的表达 　四、常用大肠杆菌表达载体 　　2. 分泌型表达载体 　　pIN III系列 　　组成结构 　　1）强启动子：Ipp（脂蛋白基因启动子）和lacUV5启动子。 　　2）调节基因：lac I 。 　　3）S-D序列和起始密码ATG。 　　4）分泌信号肽：大肠杆菌外膜蛋白基因ompa。 　　5）插入位点区（多克隆位点）。 Ipp lac P lac O S-D/ATG ompa 插入位点 第二节 外源基因在原核细胞中的表达 pIN III-comA1 　四、常用大肠杆菌表达载体 　　2. 分泌型表达载体 第二节 外源基因在原核细胞中的表达 　四、常用大肠杆菌表达载体 　　3.融合蛋白表达载体系统 　　　表达出的外源基因产物蛋白是与质粒载体上的菌体蛋白连接在一起的。 如：pGEX系列 　　 优点：便于融合蛋白的分离和纯化。 　组成结构： 　　1）启动子：tac 　　2）操纵基因：lacP 　　3）调节基因：lacI 　　4）S-D序列 　 5）ori：pBR322 ori 6）融合肽：GST(谷胱甘肽巯基转移酶） 第二节 外源基因在原核细胞中的表达 四、常用大肠杆菌表达载体 　　3.融合蛋白表达载体系统 pGEX系列 lacI tac lac O S-D/ATG GST 插入位点 TGA lacP GST融合蛋白用Glutathione Sepharose亲和层析柱分离纯化。 产物提纯: 第二节 外源基因在原核细胞中的表达 四、常用大肠杆菌表达载体 　　3.融合蛋白表达载体系统 pGEX系列 产物分离:用凝血酶或Xa因子可以把外源蛋白从GST上切下来。 第二节 外源基因在原核细胞中的表达 pGEX-2X的插入区 pGEX-1X的插入区 pGEX-3X的插入区 四、常用大肠杆菌表达载体 　　3.融合蛋白表达载体系统 pGEX系列插入区 第二节 外源基因在原核细胞中的表达 　四、常用大肠杆菌表达载体 　　4.其他融合蛋白系统 　　　His-tag（组氨酸标签） 　　　在外源多肽的N端或C端接上6个组氨酸（His）。 　　　His-tag能与Ni2+柱结合，但很容易被EDTA（或咪唑溶液）洗脱下来，可以纯化蛋白质。 第二节 外源基因在原核细胞中的表达 　五、提高外源基因表达效率的方法 　　1. 选择强启动子序列，如tac 等 　　2. 调整S-D序列与AUG碱的距离 一般为5-9bp 距离过长或过短都影响真核基因的表达。根据不同的启动子选择不同的距离 3. 改变起始密码下面的几组密码子