高效液相色谱法电子讲义.pptVIP

2、流动相的离子强度 四、离子交换色谱的影响因素 1、填料孔径的影响 2、柱长的影响 3、流速的影响 4、PH值的影响 无论在强的还是弱的阴离子交换柱上，蛋白质 均显示不同PH值影响结果，因此决定了它的保 留选择性、分离度和回收率等因素。 5、离子强度的影响 第八节 体积排阻色谱法 一、分离机理 1、体积排阻色谱法（SEC） 或空间排阻色谱法（SEC） 或凝胶色谱法 2、凝胶过滤色谱法（GFC） Sephadex 葡聚糖凝胶 3、凝胶渗透色谱法（GPC） 4、空间排斥理论 ① ② V0 死体积，相当于凝胶的粒间体积 Vs 色谱柱中凝胶的孔穴总体积 二、体积排阻色谱法的特点 三、体积排阻色谱法的固定相 （一）固定相的分类 1、按固定相基质分类 2、按固定相机械强度分类 （二）凝胶固定相的特性参数 1、渗透极限 2、分离范围 3、固流相比 在SEC中常将柱中凝胶孔体积中的溶剂称为 固定相，而将柱中凝胶颗粒间空隙体积中称为 流动相，而凝胶孔体积与凝胶颗粒间空隙体积 的比值称作固流相比。 4、柱效 （三）凝胶色谱柱的制备及谱图的特点 ①物理因素——影响凝胶色谱柱的性能 ② 扩大分离范围——使用两根以上的串联色谱 柱。 ③更换流动相 谱图的特点：在凝胶渗透色谱中，对不同分子量 聚合物色谱峰的谱带展宽不同于其它液相色谱。 ① 在低效排租色谱法，样品分子大小随V的增加 而急剧减小，而柱效却随样品分子量的增加而增 大因此在色谱图上，不同分子量组分的谱带宽度 保持不变。 ② 在高效排租色谱法，峰宽却是个变量。 四、体积排租色谱法的流动相 在体积排租色谱法中，流动相的性质对保留值 和分离选择性无影响。 ① 溶解样品的良溶剂 ② 低黏度溶剂 ③ 柱填料不能在溶剂作用下收缩或溶胀 ④ 控制流动相的PH值和离子强度 ⑤ 凝胶渗透色谱——示差折光检测器 流动相的折射率必须尽可能与样品的折射率 有较大的差别。 凝胶过滤色谱——紫外吸收检测器 使用在检测波长无紫外吸收的溶剂作流动相。 （一）凝胶渗透色谱的流动相 凝胶渗透色谱常采用甲苯，四氢呋喃和氯仿等 有机溶剂作流动相。 在用于高聚物分子量测定的凝胶渗透色谱中， 四氢呋喃是最常用的流动相，它对样品有良好 的溶解性能和低的黏度，并可使小孔径聚苯乙烯凝胶溶胀，因此被优先推荐使用。 （二）凝胶过滤色谱的流动相 在凝胶过滤色谱中，使用以水作基体具有不同 PH值的多种缓冲溶液作流动相。 五、体积排租色谱的影响因素 1、填料 ① 化学键合的硅胶 ② 亲水树脂凝胶 2、柱长 体积排租色谱的分离度与柱长的平方根成正比。 3、洗脱液 ① 以硅胶为基质的填料，PH值范围在2.0-8.0。 ② 键合硅胶如TSK系列凝胶柱在分离蛋白质时 保留时间主要取决于填料表面上的硅醇基与离 子的反应。 a) 洗脱液离子强度低时 b) 洗脱液离子强度低增加到0.3-0.5mol/L c) 常用磷酸盐和硫酸盐进行离子强度的调节 d) 用氯化钠作离子剂，疏水作用最小 e) PH值不能太低，因为H+会腐蚀不锈钢柱 4、流速 蛋白质分离时，流速对分离度的影响是一个很 重要的因素，一般在低流速下蛋白质分离是比 较理想。 5、样品容量 进样体积和样品的浓度将明显地影响蛋白质的 分离度。 样品的浓度范围一般在0.01%----0.5%. 最好是高浓度、小体积、在一般范围内可以得 到好的分离效果。蛋白质的样品体积为柱体积 的1%---3%比较合适。 6、蛋白质在变性条件下的分离 ① 变性溶剂如6mol/L盐酸胍、8mol/L脲、0.1% 十二烷基硫酸钠(SDS)等有助于精确地确定蛋白 质的分子量。 ② 在变性溶剂中，柱的分离范围因此而移到 低分子量范围内。 * * 第七章 高效液相色谱法 第一节 概述 一、史程、专用术语 二、色谱分离过程和类型 液固吸附色谱 液液分配色谱 离子交换色谱 离子对色谱 空间排阻色谱 / 三、色谱流程和仪器 四、HPLC的特点 速度快，分辨率高，灵敏度高、柱子可反复使用 第二节 基本理论 一、色谱分离过程 （一）液-固吸附色谱 流动相为液体，固定相为固体吸附剂，根据物质吸 附作用的不同来分离物质。 流动相和固定相都是液体的色谱法即为液-液 色谱，是利用样品组分在两种不相溶的液相间 的分配来进行分离。一种液相为流动相，另一 种是涂渍于载体上的固定相。 （二）液-液分配色谱 流动相极性小于固定相极性的液-液色谱法称为正相 分配色谱法 流动相极性大于固定相极性的液-液色谱法称为反相 分配色谱法 （三）离子交换色谱 （四）离子对色谱法 （五）分子排阻色谱法 二、色谱流出曲线和保留值 （一）色谱流出曲线及相关术语 （二）保留值 三、分离度 第三节 定性和定量分析 一、定性分析 （一）利用已知物对照法定性 1、利用保留