外源基因多重PCR检测.pptVIP

外源基因的多重PCR检测 实验目的 通过多重PCR，比较、分析影响多重PCR的主要因素，掌握解决方法。 掌握多重PCR引物设计的原则和方法，确立多重PCR方法快速检测转基因植物中外源基因整合的条件，为更深一步应用多重PCR检测技术奠定基础 一 多重PCR技术的基本原理 　多重PCR方法目前在植物生物学研究上应用非常广泛，包括植物种质鉴定，植物病毒的检测和分子育种。多重PCR的关键是引物设计，主要原则就是避免引物内部形成发卡结构，引物及引物之间在扩增过程中产生二聚体。其他条件例如模板纯度，退火温度也能够影响PCR扩增效果。 PCR由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成。类似于DNA的体内复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。 二 PCR的反应动力学 　 DNA扩增量呈指数上升。 反应最终的DNA 扩增量可用Y＝(1＋X)n计算。Y代表DNA片段扩增后的拷贝数，X表示每次扩增效率的平均值，n代表循环次数。 平均扩增效率的理论值为100%，但在实际反应中平均效率达不到理论值。 反应初期，靶序列DNA片段的增加呈指数形式，随着PCR产物的逐渐积累，被扩增的DNA 片段不再呈指数增加，而进入线性增长期或静止期， 即出现“停滞效应” ，这种效应称平台期(Plateau)。 平台期产生的因素 ①dNTP和引物浓度下降