13章基因治疗原理与应用研究.pptVIP

* * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * （二）核酶的应用 与一般的反义RNA相比，核酶具有较稳定的空间结构，不易受到RNA酶的攻击。更重要的是，核酶在切断mRNA后，又可从杂交链上解脱下来，重新结合和切割其它的mRNA分子。 * 第五节 基因治疗的应用研究 * 1．腺苷脱氨酶(ADA)和嘌呤核苷磷酸化酶 (PNP)缺乏症 2．珠蛋白生成障碍性贫血和血红蛋白病 3．血友病和其他血浆蛋白缺乏症 4．苯丙酮酸尿症和其他先天性代谢缺陷病 5．莱-纳(Lesch-Nyhan)综合征 6．家族性高胆固醇血症 7．囊性纤维化病 一、遗传病的基因治疗研究 * 第一例基因治疗 －腺苷脱氨酶缺乏症 生理：腺苷脱氨酶是一种细胞内酶，在核酸代谢中起重要作用，使淋巴细胞中的脱氧腺苷脱氨成为脱氧肌苷，最后代谢为尿酸，排出体外。 病理：腺苷脱氨酶缺乏－脱氧腺苷不能脱氨－脱氧腺细胞内堆积－淋巴细胞死亡－机体免疫功能缺乏。 * 治疗基础 腺苷脱氨酶基因位于20号染色体长臂 1983年腺苷脱氨酶基因被克隆 应用逆转录病毒可将该基因送入缺乏腺苷脱氨酶基因的淋巴细胞 新输入的腺苷脱氨酶基因可在原来没有此基因的淋巴细胞中表达 * 基因治疗的临床应用 Ashanti de Silva Ashanti was the first patient to be treated with gene therapy. Injections repeated 7 times in first 10.5 months ADA: 1% 25% * 治疗步骤 抽取病人骨髓，分离淋巴细胞 将病人淋巴细胞与携带腺苷脱氨酶基因的逆转录病毒载体混合培养，使腺苷脱氨酶进入淋巴细胞 清洗淋巴细胞，去除多余病毒载体。应用抗性基因等方法选择阳性细胞，检测细胞内外腺苷脱氨酶含量 * 治疗步骤 确定腺苷脱氨酶在淋巴细胞有满意表达后，将带有此基因的淋巴细胞输回患者体内。 密切观察病人各项免疫指标的变化，必要时加以调整和重复。 经如上治疗后，患病女童免疫功能基本恢复。以后又连续进行了多次输入。 * 乙型血友病 薛京伦 (复旦大学) 1991, 皮肤成纤维细胞 Factor IX: 5% * 逆转录病毒载体 +FⅨcDNA 重组体 5’ LTR FⅨ neo SV PSO LTR 3’ ①导入仓鼠细胞（CHO ）→FⅨ表达； ②导入乙型血友病患者皮肤成纤维细胞（体外培养）→FⅨ表达； ③91年，导入乙型血友病患者皮肤成纤维细胞（体外培养）→回植病人皮下→FⅨ基因表达，FⅨ基表达水平达正常人的5%。 是我国基因治疗成功的例子。 * 二、恶性肿瘤基因治疗研究 常用基因治疗策略： 基因添加 基因干预技术 自杀基因治疗—分子化疗 肿瘤的免疫基因治疗。 提高化疗效果的辅助基因治疗：药物增敏基因治疗；耐药基因治疗。 * 三、病毒性疾病的基因治疗研究 可用基因治疗的策略 1．调节机体免疫应答 2. 基因干预，抑制病毒复制 * 第六节 基因治疗的问题与展望 安全性问题 1999年首例基因治疗失败事件 只限于体细胞，提倡间接体内法、主要用于单基因遗传病治疗、疗效显著并经过动物实验验证等。 * 社会伦理问题 禁止用于生殖细胞 防止不当应用（如体育上） * 技术问题 目的基因及调控元件选择 安全高效载体构建及转移技术 靶细胞选择 * 重组载体pRevTRE/HSVtk构建流程 基因治疗应用实例 -------乳腺癌的自杀基因治疗研究 * MCF/TRE/tk/Tet-On细胞株的建立 * BALB/c裸鼠乳腺癌移植瘤动物模型的建立 * BALB/c裸鼠移植瘤的抑瘤实验 A：DMEM 组； B：GCV+Dox 组； C：GCV+病毒组； D：Dox+GCV+病毒组 * BALB/c裸鼠移植瘤治疗结束后的肿瘤体积 * BALB/c裸鼠移植瘤的抑瘤实验 * M: 100 bp Marker； 1： DMEM 组荷瘤裸鼠肿瘤；2： GCV+Dox 组荷瘤裸鼠肿瘤； 3： GCV+病毒组荷瘤裸鼠肿瘤；4： Dox+GCV+病毒组荷瘤裸鼠肿瘤 RT-PCR 检测肿瘤组