研究生PCR聚合酶链反应.ppt

如何提高PCR扩增的特异性？ 升高退火温度可增加引物与模板结合的特异性； 缩短退火和延伸时间，可减少错误引发及多余的DNA聚合酶分子参与酶促延伸的机会； 降低引物和酶的浓度也可以减少错误引发，尤其是能减少引物二聚体的引发； 改变Mg2+的浓度可进一步提高扩增的特异性。 引物设计的特异性； 减少循环次数； 热启动（Hot Start）。即首先将模板变性，然后在较高温度时加入Taq DNA聚合酶、引物及MgCl2等一些重要成分，这样使得引物在较高温度下与模板退火，提高了反应的严谨性，使扩增更特异； 采用二对引物即外引物和内引物进行扩增来提高扩增的特异性。 RT-PCR及定量RT-PCR （1）RT-PCR（reverse transcription-PCR） 原理：先在逆转录酶的作用下、以mRNA为模板合成互补的cDNA（complementary DNA），再以cDNA为模板进行PCR反应。 是一种快速、简便、敏感性极高的检测mRNA表达的方法。 PCR技术的主要类型 常用的两种逆转录酶 AMV（avian myeloblastosis virus）： 酶活性最适温度42℃ MMLV（Moloney murine leukemia virus）：酶活性最适温度37℃ （2）定量RT-PCR（qRT-PCR）： 利用RT-PCR对mRNA水平进行半定量或绝对定量分析。 半定量R