cell流培养用液.pptVIP

;教学目的: 1、掌握细胞培养对水的要求。 2、了解常用的平衡盐溶液的配制及使用 方法。 3、了解细胞培养常用液有那些。 4、了解常用的培养液的种类。;Balanced salt solution, BSS 组成：无机盐、葡萄糖 作用：1、维持渗透压、保持pH值稳定、提供简 单营养；2 、湿润组织，防止组织块干涸，并能洗涤组织块上的血污、杂质；3 、作为配制其它溶液的基础溶液（消化液：分散细胞；抗生素溶液；基础培养基等） ;注意事项：;用途：清洗材料、洗涤细胞、配制其他溶液。 ;分类： 按来源分：天然培养基 人工合成培养基（基础培养基） 按基质状态分：半固体: 琼脂，明胶，血浆 液体 ;思考题：;生长液：基本培养基加入8%-10%的血清； 维持液：基本培养基加入3%-5%的血清； 完全培养基：人工合成培养基加上血清； 基础培养基又叫做人工合成培养基。;Hank’s+水解乳蛋白（进口）;一、培养基的基本要求;营养成分;促生长因子及激素; 当细胞内、外环境的分子浓度不同时就会产生渗透压。这种情况下，水分通过渗透流入或流出细胞，从而改变细胞的内环境。高渗透压迫使水分从细胞中扩散出来导致细胞收缩，这种情况会使DNA和蛋白遭到破坏、细胞周期停滞以及最终使细胞死亡。; PH值;（二）天然培养基;1.血清的主要作用;2.使用血清的缺点; ;4、鉴定内容：;96孔板 每孔200ul 细胞悬液稀释至 5个/ml，1个/200ul （1）计算细胞悬液的总量及不同样品的使用量 标准样 3个96孔板 20ml/板 备检样 3个96孔板 20ml/板 （2）稀释 细胞浓度通常为105～107 105个细胞/毫升 5个细胞/毫升 稀释用已经灭菌的基础培养基 105个细胞/毫升=100个细胞/微升 取1ul细胞悬液加基础培养基至20ml，即 100个细胞/20毫升=5个细胞/毫升=1个/200ul 倒置显微镜观察，标记含单个细胞的板孔 ;（3）吹打 混匀细胞悬液 加入96孔板 倒置显微镜观察 标记出单个细胞的板孔 继续培养 每周观察一次 三周后长出集落，每天观察一次 计算出克隆形成百分率。 实验历时一个月！ 注意：选择容易形成克隆的细胞进行实验 （原代细胞不行）！ ;5.血清的使用和储存; ◎疫苗的灭活: 一种被杀死的病毒,将其输入人体内后既不会使人染病,又可以促使人产生抗体抵御病毒的入侵. ◎微生物的灭活: 使微生物丧失活性. ◎血清的灭活: 除去血清中的补体成分,避免对细胞产生毒害作用;鼠尾胶原; 含有鼠尾胶原的培养基;（三）合成培养基;基本培养基的组分;配制干粉培养基的注意事项：;配制步骤：;基础培养基的分类： 1、199培养基。 2、低限量基础Eagle培养基（minimum essential media，MEM）。 3、DMEM （Dulbecco’s modified Eagle medium）：增加了各成分的用量；分高糖型和低糖型。 4、IMDM （Iscove’s modified Dulbecco’s medium）属高糖型；适合于细胞密度低，细胞生长较困难的情况。; 无血清培养基(serum?free?medium,SFM):是不需要添加血清就可以维持细胞在体外较长时间生长繁殖的合成培养基。 虽然基础培养基加少量血清所配制的完全培养基可以满足大部分细胞培养的要求，但对有些实验却不适合，如：观察一种生长因子对某种细胞的作用，这时需要排除其他生长因子的干扰；又如需要测定某种细胞在培养过程中分泌某种物质（抗体、生长因子）的能力；或者要大规模的培养某种细胞，以获得它们的分泌产物。? ;无血清培养基的基本配方;无血清培养基的使用方法 ; ;;1、胰蛋白酶（trypsin）溶液 　原理：细胞间蛋白质水解，使细胞解离 活性用消化酪蛋白的能力表示：1：125或1：250，即一份胰酶可消化１２５或２５０份的酪蛋白 配置浓度：0.1%～0.25%，作用5-15分钟； 最适PH值是8～9； 注意:用无钙镁溶液配置，如ＰＢＳ和Ｄ－Ｈank’s液,血清和钙镁离子均可抑制其活性. 过滤除菌 小包装分装，储存于－２０℃ 如何中