GB/T 19438.3-2004H7亚型禽流感病毒荧光　RT-PCR　检测方法.pdf

GB/T19438.3-2004 月U 舀 GB/T19438-2004《禽流感病毒荧光RT-PCR检测方法》分为以下四个部分: — GB/T19438.1-2004《禽流感病毒通用荧光RT-PCR检测方法))); — GB/T19438.2-2004((H5亚型禽流感病毒荧光RT-PCR检测方法》; — GB/T19438.3-2004((H7亚型禽流感病毒荧光RT-PCR检测方法)); - GB/T19438.4-2004((H9亚型禽流感病毒荧光RT-PCR检测方法》。 本部分的附录A为资料性附录 本部分由中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局提出。 本部分起草单位:中华人民共和国北京出人境检验检疫局、深圳市匹基生物工程股份有限公司。 本部分主要起草人:高志强、张鹤晓、郭晋优、刘继红、吴丹。 GB/T19438.3-2004 H7亚型禽流感病毒荧光RT-PCR 检 测 方 法 1 范 围 本部分规定了荧光RT-PCR检测H7亚型禽流感病毒的操作方法 本部分适用于活禽及其产品中H7亚型禽流感病毒的检测。 2 规范性引用文件 下列文件中的条款通过本部分的引用而成为本部分的条款 凡是注日期的引用文件，其随后所有 的修改单(不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本部分，然而，鼓励根据本部分达成协议的各方研究 是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注 日期的引用文件，其最新版本适用于本部分。 GB/T19438.1-2004 禽流感病毒通用荧光RT-PCR检测方法 3 缩略语 下列缩略语适用于本部分。 荧光RT-PCR 荧光反转录一聚合酶链式反应。 2 3 Ct值 每个反应管内的荧光信号达到设定的阐值时所经历的循环数 3 3 RNA 核糖核酸。 3.4 Taq酶 TaqDNA聚合酶。 3.5 PBS 磷酸盐缓冲盐水。 3.6 DEPC 焦碳酸乙二醋。 4 原理 采用TagMan方法，通过比对禽流感病毒血凝素基因，设计一对仅在H7亚型禽流感病毒血凝素基 因间保守的特异性引物和一条特异性的荧光双标记探针 探针的结合部位位于目的扩增片段内部。其 中5端‘标记FAM荧光素为报告荧光基团(R,3’端标记的TAMRA荧光素(Q)在近距离内能吸收5’端 荧光基团发出的荧光信号，称为淬灭荧光基团。反应在退火时，引物和探针同时与 目的基因片段结合 t GB/T19438.3-2004 探针上R基团发出的荧光信号被Q基团所吸收，仪器检测不到荧光信号;而反应进行到延伸阶段时， 丁“，酶发挥5-3’的外切核酸酶功能，将探针降解。这样探针上的R基团游离出来，所发出的荧光不再 为Q所吸收而被检测仪所接收 随着PCR反应的循环进行，PCR产物与荧光信号的增长呈现对应 关系。 5 试剂和材料 5.1 试荆 除特别说明外，本标准所用试剂均为分析纯，所用液体试剂均须使用无RNA酶的容器(用DEPC 水处理后高压灭菌)进行分装。 5.1.1H7亚型禽流感病毒荧光RT-PCR检测试剂盒，，:试剂盒的组成、说明及使用注意事项参见附 录A. 5.1.2 三氯甲烷。 5.1.3 异丙醇。 5.1.4 75%乙醇，用新开启的无水乙醇和无RNA酶的水配制。 5.1.5 0.01mol/L(pH7.2)的PBS;配方见GB/T19438.1-2004中附录Ao121℃士2*C,15min 高压灭菌后，无菌条件下按10000IU/ml一加人青霉素和链霉素 52 仪器设备 5.2.1 高速台式冷冻离心机:要求最大离心力在 12000r/min以上 5.2.2 荧光PCR仪。 5.2.3 计算机 5.2.4 2℃一8℃冰箱。 5.2.5 一20℃冰箱 5,2.6 微量加样器:0.5pL--10p.L;5pL-20p-I;201,[r 200pL;