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- 2019-01-03 发布于四川
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- | 2004-02-14 颁布
- | 2004-02-15 实施
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GB/T19438.3-2004
月U 舀
GB/T19438-2004《禽流感病毒荧光RT-PCR检测方法》分为以下四个部分:
— GB/T19438.1-2004《禽流感病毒通用荧光RT-PCR检测方法)));
— GB/T19438.2-2004((H5亚型禽流感病毒荧光RT-PCR检测方法》;
— GB/T19438.3-2004((H7亚型禽流感病毒荧光RT-PCR检测方法));
- GB/T19438.4-2004((H9亚型禽流感病毒荧光RT-PCR检测方法》。
本部分的附录A为资料性附录
本部分由中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局提出。
本部分起草单位:中华人民共和国北京出人境检验检疫局、深圳市匹基生物工程股份有限公司。
本部分主要起草人:高志强、张鹤晓、郭晋优、刘继红、吴丹。
GB/T19438.3-2004
H7亚型禽流感病毒荧光RT-PCR
检 测 方 法
1 范 围
本部分规定了荧光RT-PCR检测H7亚型禽流感病毒的操作方法
本部分适用于活禽及其产品中H7亚型禽流感病毒的检测。
2 规范性引用文件
下列文件中的条款通过本部分的引用而成为本部分的条款 凡是注日期的引用文件,其随后所有
的修改单(不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本部分,然而,鼓励根据本部分达成协议的各方研究
是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注 日期的引用文件,其最新版本适用于本部分。
GB/T19438.1-2004 禽流感病毒通用荧光RT-PCR检测方法
3 缩略语
下列缩略语适用于本部分。
荧光RT-PCR
荧光反转录一聚合酶链式反应。
2 3
Ct值
每个反应管内的荧光信号达到设定的阐值时所经历的循环数
3 3
RNA
核糖核酸。
3.4
Taq酶
TaqDNA聚合酶。
3.5
PBS
磷酸盐缓冲盐水。
3.6
DEPC
焦碳酸乙二醋。
4 原理
采用TagMan方法,通过比对禽流感病毒血凝素基因,设计一对仅在H7亚型禽流感病毒血凝素基
因间保守的特异性引物和一条特异性的荧光双标记探针 探针的结合部位位于目的扩增片段内部。其
中5端‘标记FAM荧光素为报告荧光基团(R,3’端标记的TAMRA荧光素(Q)在近距离内能吸收5’端
荧光基团发出的荧光信号,称为淬灭荧光基团。反应在退火时,引物和探针同时与 目的基因片段结合
t
GB/T19438.3-2004
探针上R基团发出的荧光信号被Q基团所吸收,仪器检测不到荧光信号;而反应进行到延伸阶段时,
丁“,酶发挥5-3’的外切核酸酶功能,将探针降解。这样探针上的R基团游离出来,所发出的荧光不再
为Q所吸收而被检测仪所接收 随着PCR反应的循环进行,PCR产物与荧光信号的增长呈现对应
关系。
5 试剂和材料
5.1 试荆
除特别说明外,本标准所用试剂均为分析纯,所用液体试剂均须使用无RNA酶的容器(用DEPC
水处理后高压灭菌)进行分装。
5.1.1H7亚型禽流感病毒荧光RT-PCR检测试剂盒,,:试剂盒的组成、说明及使用注意事项参见附
录A.
5.1.2 三氯甲烷。
5.1.3 异丙醇。
5.1.4 75%乙醇,用新开启的无水乙醇和无RNA酶的水配制。
5.1.5 0.01mol/L(pH7.2)的PBS;配方见GB/T19438.1-2004中附录Ao121℃士2*C,15min
高压灭菌后,无菌条件下按10000IU/ml一加人青霉素和链霉素
52 仪器设备
5.2.1 高速台式冷冻离心机:要求最大离心力在 12000r/min以上
5.2.2 荧光PCR仪。
5.2.3 计算机
5.2.4 2℃一8℃冰箱。
5.2.5 一20℃冰箱
5,2.6 微量加样器:0.5pL--10p.L;5pL-20p-I;201,[r 200pL;
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